JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:43 min. • July 8th, 2025
Iniziare con il DNA plasmidico codificante una proteina fluorescente o la sospensione di pDNA in terreni. Aggiungere nanoparticelle magnetiche biocompatibili rivestite di polimero cationico alla sospensione di pDNA e incubare.
I polimeri cationici caricati positivamente interagiscono elettrostaticamente e si coniugano con il pDNA caricato negativamente, provocando la condensazione del pDNA e la formazione di "poliplessi magnetici" con una carica complessivamente positiva.
Ora, trasferire la miscela polyplex in una piastra multipozzetto contenente una coltura di cellule neuronali di topo primarie aderenti. Montare la piastra multipozzetto su una piastra magnetica e incubare.
Il campo magnetico generato dalla piastra magnetica provoca il sedimento e l'accumulo dei poliplessi sulla superficie della cellula neuronale. Questo stretto contatto con la superficie cellulare facilita il legame non specifico di poliplessi caricati positivamente ai proteoglicani associati alla membrana cellulare caricati negativamente.
Successivamente, i poliplessi vengono internalizzati tramite endocitosi, un processo in cui le regioni locali della membrana cellulare si invaginano e si staccano per formare vescicole legate alla membrana chiamate endosomi.
All'interno del citoplasma, i polimeri cationici del poliplesso inducono l'accumulo di protoni nell'endosoma. L'afflusso simultaneo di ioni cloruro per mantenere la neutralità della carica aumenta la forza ionica endosomiale, portando all'afflusso di acqua.
Alla fine, gli endosomi si gonfiano e si rompono a causa della pressione osmotica, rilasciando poliplessi nel citoplasma. Il pDNA condensato all'interno dei poliplessi facilita l'aumento della motilità citosolica, mentre i polimeri cationici proteggono il pDNA dalla degradazione della nucleasi citoplasmatica.
In seguito alla dissociazione dei poliplessi, il pDNA liberato - durante l'appropriata fase del ciclo cellulare quando la membrana nucleare si disassembla temporaneamente - viene traslocato nel nucleo. Le cellule trasfettate con successo con pDNA esprimono proteine fluorescenti.
Per coltivare i motoneuroni, diluirli a 5.000-10.000 cellule in 500 microlitri di terreno di coltura per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Quindi, rimuovere la soluzione di laminato con un puntale per pipetta P1000. Trasferire immediatamente i motoneuroni diluiti nel terreno di coltura sulle piastre di rivestimento per evitare che si secchino.
Per preparare il DNA, risospendere 1 microgrammo di DNA in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale e agitare per 5 secondi. Per preparare il tubo di perline, risospendere 1,5 microlitri di perline in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline a 50 microlitri di soluzione di DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
Durante questa incubazione, prelevare 100 microlitri di terreno di coltura dal pozzetto che verrà trasfettato. Successivamente, trasferire 100 microlitri della miscela di microsfere di DNA in ciascun pozzetto e incubare la piastra a 24 pozzetti per 20-30 minuti sulla piastra magnetica a 37 gradi Celsius.