JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:02 min • July 8th, 2025
Per trasdurre le cellule ospiti con RNA contenente vettori retrovirali, prendere una provetta contenente vettori confezionati in terreni adatti. Ogni vettore contiene un capside virale, contenente il complemento di RNA del transgene da integrare nel genoma dell'ospite e importanti enzimi virali. Un doppio strato lipidico circonda il capside per facilitare l'ingresso nella cellula ospite.
Aggiungere i vettori in presenza di un reagente di trasfezione adatto al pozzetto di una piastra di coltura contenente la sospensione della cellula ospite. Copri il piatto. Centrifugare a bassa velocità per consentire la trasduzione dello spin. Questo avvicina il vettore virale alla superficie della cellula ospite, aumentando l'efficienza di trasduzione.
Contemporaneamente, i policationi nel reagente di trasfezione neutralizzano le cariche negative sul virus e sulla cellula ospite, promuovendo l'adsorbimento virale sulle cellule bersaglio.
Di conseguenza, i recettori sulla superficie del virus facilitano la sua fusione con la membrana ospite. Il capside virale entra nella cellula e si rompe, rilasciando RNA transgenico ed enzimi virali nel suo citoplasma.
All'interno del citoplasma, la trascrittasi inversa virale converte l'RNA in un DNA complementare a singolo filamento, trasformandolo successivamente in DNA provirale a doppio filamento. Il DNA risultante entra nel nucleo. L'enzima integrasi virale media l'integrazione del DNA provirale nel genoma ospite, con conseguente trasduzione delle cellule.
Raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttrice virale. A questo punto, le celle dovrebbero essere ben distanziate con una morfologia definita. Quindi, aspirare con cura i 2 millilitri superiori di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti contenente le cellule del midollo osseo. Evitare di aspirare le cellule del midollo osseo che di solito sono concentrate al centro del pozzo.
Aggiungere 3 millilitri di surnatante virale appena integrato a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti contenente le cellule del midollo osseo. Dopo aver avvolto le piastre nella plastica, ripetere la trasduzione di centrifuga, quindi posizionare le piastre non avvolte nell'incubatore di coltura tissutale. Dopo 24 ore il terzo giorno, rimuovere e sostituire 2 millilitri di terreno dai pozzetti.