JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:44 min • July 8th, 2025
La steatosi epatica è una condizione patologica caratterizzata da un eccessivo accumulo di grassi negli epatociti, un tipo di cellule epatiche importante. I grassi si depositano sotto forma di goccioline lipidiche di varie dimensioni nel citoplasma degli epatociti.
Strutturalmente, una gocciolina lipidica contiene un nucleo di grassi neutri e idrofobici come i trigliceridi e gli esteri del colesterolo. Il nucleo è circondato da un monostrato di fosfolipidi decorato con varie proteine.
Per visualizzare la deposizione di grasso, prelevare una piastra a più pozzetti contenente una coltura di epatociti aderente. Le cellule vengono pretrattate con un mezzo steatogeno per indurre l'accumulo di goccioline lipidiche al loro interno.
Aggiungere la concentrazione desiderata di paraformaldeide, che si diffonde nelle cellule, e reticolare le proteine. Questo passaggio disattiva le proteasi e preserva la struttura degli epatociti. Scartare la paraformaldeide e aggiungere la soluzione di Olio-rosso-O contenente il colorante organico disciolto in isopropanolo.
L'isopropanolo funge da solvente vettore per le molecole di Olio-rosso-O scarsamente solubili. Questo aiuta le molecole di colorante a entrare negli epatociti fissi e alla fine a raggiungere le goccioline lipidiche. Una volta all'interno, il colorante si trasferisce dall'isopropanolo ai lipidi neutri a causa della sua maggiore affinità, formando il complesso colorante-lipidi. Ciò si traduce in una colorazione rossa delle goccioline lipidiche.
Scartare il colorante in eccesso e osservare le cellule al microscopio. Le goccioline lipidiche intracellulari appaiono di colore rosso intenso.
Mettere un vetrino coprioggetti per colture cellulari in ogni pozzetto in una piastra a 24 pozzetti e seminare le cellule HepG2, come descritto nel manoscritto del testo. Dopo l'opportuna incubazione, lavare le cellule con 1 millilitro di PBS e scartare il surnatante. Fissarli con 1 millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Scartare la paraformaldeide in eccesso e sciacquare le cellule con 1 millilitro di acqua distillata.
Quindi, aggiungere 1 millilitro di isopropanolo al 70% e incubare per 5 minuti. Scartare l'eccesso di isopropanolo, aggiungere 1 millilitro di soluzione di Olio rosso O e incubare per 30 minuti. Eliminare la soluzione di Olio rosso O in eccesso, quindi risciacquare con 1 millilitro di acqua distillata. Osservare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 400x.