JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:10 min. • July 8th, 2025
Le cellule muscolari lisce vascolari, o VSMC, sono i componenti cellulari prominenti della tunica media, lo strato intermedio della parete dei vasi sanguigni. In risposta a segnali patologici o all'invecchiamento, queste cellule mediano la calcificazione vascolare, un fenomeno di accumulo di calcio nella matrice extracellulare.
Prelevare una piastra a più pozzetti contenente uno strato aderente di coltura VSMC aortica murina precalcificata. Incubare le cellule con una soluzione di formalina per reticolare le proteine cellulari e stabilizzare la struttura VSMC prima della colorazione.
Iniziare la colorazione di von Kossa aspirando la formalina dal pozzetto e aggiungendo la soluzione di nitrato d'argento. Incubare la piastra sotto una fonte di luce appropriata.
Una volta che la soluzione di nitrato d'argento raggiunge i siti di calcificazione nella matrice extracellulare dello strato VSMC, gli ioni d'argento sostituiscono gli ioni calcio legati al fosfato. Ciò si traduce in una colorazione gialla transitoria. In presenza di materia organica e luce, la degradazione fotochimica del fosfato d'argento provoca la formazione di argento metallico di colore nero.
Scartare la quantità massima di soluzione di nitrato d'argento esaurita. Trattare le cellule con una soluzione di tiosolfato di sodio. Questa soluzione converte i sali d'argento residui in un complesso idrosolubile, che può essere rimosso tramite un risciacquo finale con acqua, migliorando il contrasto delle macchie.
Visualizzare le cellule colorate per individuare i depositi neri insolubili che indicano la calcificazione.
Per indurre la calcificazione nelle cellule muscolari lisce vascolari, trasferire le cellule nella piastra di coltura a sei pozzetti e lasciarle aderire. Quindi, realimentare le cellule nei terreni di calcificazione. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per almeno sette giorni. Successivamente, aspirare il terreno dalla piastra di coltura cellulare. Lavare le celle una volta in acqua deionizzata.
Fissare le cellule mettendole in 1 millilitro di formalina al 10% a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi, rimuovere la formalina e lavare le celle fissate con acqua distillata per 5 minuti.
Successivamente, incubare le cellule in 1 millilitro di soluzione di nitrato d'argento al 5% sotto una lampadina da 60 a 100 watt per 1 o 2 ore. Successivamente, aspirare la soluzione di nitrato d'argento e lavare con acqua distillata per 5 minuti. Dopo 5 minuti, rimuovere l'argento non reagito ponendo le cellule in 1 millilitro di soluzione di tiosolfato di sodio al 5% in acqua distillata per 5 minuti. Successivamente, sciacquare le celle con acqua distillata per 5 minuti. Le cellule colorate con von Kossa sono ora pronte per l'imaging con la microscopia ottica invertita standard.