JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:14 min • July 8th, 2025
Per la colorazione specifica del citoplasma cellulare in microambienti dei tessuti molli, ottenere un rene di topo appena raccolto. Trattarlo con una soluzione fissativa contenente formaldeide, acido acetico glaciale e metanolo. Incubare a basse temperature.
La formaldeide penetra nelle cellule, reticolando le proteine alle proteine e le proteine agli acidi nucleici. Il metanolo sposta l'acqua dai tessuti e coagula le proteine. L'acido acetico provoca acidificazione intracellulare e gonfiore dei tessuti, contrastando così il restringimento dei tessuti causato dal metanolo.
La fissazione inattiva gli enzimi e stabilizza la morfologia dei tessuti per la successiva colorazione. Rimuovere i fissativi in eccesso utilizzando il tampone. Incubare il tessuto con eosina Y, un colorante acido.
L'eosina penetra nelle cellule fisse ed entra nel citoplasma. L'ambiente acido del citoplasma, dal trattamento con acido acetico, provoca la massima protonazione dei gruppi amminici delle proteine citoplasmatiche.
L'eosina, con gruppi funzionali caricati negativamente, interagisce elettrostaticamente con gruppi protonati di proteine, formando un complesso colorante-proteina stabile, e colora il citoplasma di rosa dopo l'accumulo. Dopo l'incubazione, tagliare il rene colorato in piccoli pezzi, seguito da disidratazione dei tessuti con concentrazioni crescenti di etanolo.
Incorporare il tessuto renale nella cera di paraffina. Ottenere sezioni sottili di tessuto utilizzando un microtomo. Inoltre, reidratare le sezioni per l'analisi microscopica.
I nuclei cellulari non colorati appaiono bianchi su un citoplasma colorato di rosa, consentendo la visualizzazione di microstrutture renali come i tubuli contorti prossimali, comprendenti cellule epiteliali con bordi a spazzola, o dotti collettori, che sono rivestiti da cellule epiteliali appiattite senza bordi a spazzola.
Inizia fissando i campioni di tessuto molle. Riempire una provetta da centrifuga da 50 millilitri con una soluzione fissativa contenente 9,5 millilitri di formaldeide al 4% e 0,5 millilitri di acido acetico glaciale. Aggiungere il campione di tessuto molle alla provetta da centrifuga e conservarlo in frigorifero per 24-72 ore.
Dopo la refrigerazione, lavare il campione di tessuto molle con la soluzione DPBS per 1 ora. Quindi, colorare il campione mettendolo in 2 millilitri di soluzione di colorazione Y di eosina e incubarlo su una piastra di agitazione orizzontale per 24 ore.
Il giorno successivo, estrarre con cautela il campione di tessuto molle dal contenitore del campione e rimuovere l'agente colorante in eccesso con carta velina di cellulosa. Mettilo in un contenitore conico sopra una fase di vapore di etanolo per la conservazione e l'ulteriore utilizzo.