Colorazione H&E di sezioni di tessuto incluse in paraffina: una tecnica di colorazione differenziale per visualizzare sezioni di tessuto epatico utilizzando la combinazione di coloranti ematossilina ed eosina

Iniziare la colorazione con ematossilina ed eosina prelevando un vetrino contenente la sezione di tessuto inclusa in paraffina. Immergere il vetrino in una soluzione di deparaffinazione contenente xilene, un solvente organico che dissolve lo strato di paraffina attorno al tessuto, rendendolo accessibile alle macchie nei passaggi successivi.

Trattare la sezione di tessuto con alcol assoluto per rimuovere lo xilene. Immergere il tessuto in concentrazioni decrescenti di alcol. Questo passaggio reidrata il tessuto sostituendo l'alcol con l'acqua per una migliore compatibilità con i coloranti idrosolubili.

Colorare il tessuto con ematossilina basica, che nella sua forma ossidata si lega al mordente, un catione metallico. Questo complesso si lega elettrostaticamente agli acidi nucleici nel genoma, colorando il nucleo di viola.

Immergere la sezione colorata in una soluzione di differenziazione acida per rimuovere l'ematossilina in eccesso dal citoplasma, facendo apparire distinto il nucleo che trattiene il colorante. Trattare il tessuto con un agente azzurrante alcalino per neutralizzare gli acidi liberi. Questo fa regredire il colore del colorante viola al blu, migliorando i dettagli nucleari.

Immergere il vetrino in una soluzione acida di eosina per colorare i componenti proteici di base nel citoplasma e le fibre del tessuto connettivo nei toni del rosso al rosa. Trattare il tessuto con alcol per eliminare l'eccesso di eosina. Utilizzare concentrazioni crescenti di etanolo per disidratare il tessuto. Immergere il vetrino nello xilene per eliminare eventuali reagenti rimanenti.

Dopo l'imaging, le cellule nella sezione di tessuto mostrano nuclei blu chiari e regioni citoplasmatiche rosa.

Deparaffinare i vetrini immergendoli in xilene al 100%, due volte, per 15 minuti ogni volta. Quindi, reidratare i vetrini attraverso un gradiente di etanolo. Per ogni soluzione, immergere da 8 a 10 volte, per due secondi per immersione, fino a quando il liquido non fuoriesce in modo pulito dai vetrini. Posizionare i vetrini in ematossilina Harris filtrata al 100% per quattro minuti.

Dopo quattro minuti, trasferiteli rapidamente nel contenitore di acqua deionizzata. Far scorrere l'acqua deionizzata nell'angolo posteriore del contenitore più lontano dalle sezioni. Svuotare periodicamente il contenitore fino a quando l'acqua non è più viola.

Controllare rapidamente l'intensità dell'ematossilina su un microscopio da dissezione utilizzando luci a collo d'oca. Riportare i vetrini al 100% di ematossilina per un minuto, se è necessaria un'ulteriore colorazione.

Una volta ottenuta la colorazione con ematossilina desiderata, immergere due volte i vetrini in acido cloridrico allo 0,05%, quindi trasferirli immediatamente nel contenitore con acqua deionizzata pulita. Svuotare e riempire il contenitore con acqua due volte.

Trasferire i vetrini in due contenitori di etanolo al 95% per 30 secondi ciascuno. Posizionare i vetrini nella soluzione di eosina Y floxina-B per due minuti.

Trascorsi i due minuti, trasferire nuovamente i vetrini nel precedente contenitore di etanolo al 95%, quindi controllare l'intensità del colore al microscopio da dissezione. Se la colorazione non è sufficiente, rimettere alla soluzione di eosina per 30 secondi. Ripetere se necessario.

Una volta ottenuta la colorazione dell'intensità desiderata, trasferire i vetrini al 100% di isopropanolo per 15 secondi. Sostituire con isopropanolo fresco al 100% e riposizionare i vetrini nell'isopropanolo per altri 15 secondi. Ripetere questo processo per un totale di sei lavaggi con isopropanolo.

Dopo aver immerso in xilene al 100% per tre minuti, rimuovere un vetrino, aggiungere un mezzo di montaggio sufficiente a coprire le sezioni, quindi immergere il vetrino in xilene al 100%.

Applicare un vetrino coprioggetti sul vetrino e tamponare il mezzo di montaggio in eccesso su un tovagliolo di carta fino a quando non si vede solo una linea sottile. Quindi, immergi un fazzoletto nello xilene e pulisci il retro del vetrino per rimuovere il mezzo che ha gocciolato.

Posizionare il vetrino su una superficie robusta ma mobile, come un pezzo di cartone, e lasciare evaporare lo xilene nella cappa per 10 minuti. Lasciare i vetrini a temperatura ambiente per una notte per consentire al mezzo di montaggio di indurirsi prima dell'imaging.