JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:33 min. • July 8th, 2025
Durante le metastasi del cancro, le cellule tumorali di un tumore primario viaggiano attraverso il sistema circolatorio, stravasano in organi distanti e stabiliscono tumori secondari.
Per valutare le metastasi polmonari in un modello murino di carcinoma mammario a cui sono state iniettate cellule 4T1, cellule di carcinoma mammario altamente metastatico, preparare una sospensione cellulare, comprese le cellule 4T1, isolate dai polmoni raccolti. Centrifugare la sospensione e risospendere le cellule in un terreno contenente 6-tioguanina, 6-TG - un analogo della guanina. Seminare la sospensione cellulare in una piastra di coltura.
Il 6TG entra nelle cellule normali dove l'enzima transferasi specifico lo converte in nucleotide 6-TG, un nucleotide tossico. Questi nucleotidi citotossici vengono incorporati nel DNA, causando danni al DNA, ed eliminano selettivamente le cellule dalla coltura. Le cellule 4T1 hanno una ridotta capacità di formare nucleotidi tossici, facilitando la loro sopravvivenza e aderenza alla piastra. A seconda della capacità proliferativa delle cellule, formano colonie.
Trattare le cellule con metanolo. Il metanolo permeabilizza le cellule e denatura le proteine cellulari. Incubare le cellule con blu di metilene.
Il colorante caricato positivamente entra nella cellula, interagisce con il DNA caricato negativamente, intercalandosi negli spazi tra le coppie di basi adiacenti dei filamenti di DNA. Si lega anche all'RNA nel citoplasma, ma con minore affinità. I nuclei si colorano di blu scuro a causa dell'elevata concentrazione di DNA rispetto al citoplasma a causa della bassa concentrazione di RNA. Le colonie metastatiche appaiono come punti blu.
Immagina la targa. Utilizzare il software per determinare le colonie metastatiche, quantificando il carico metastatico nei polmoni del topo.
Porta il volume del tubo fino a 10 millilitri con 1X HBSS. Quindi, versare il contenuto su un colino cellulare da 70 micrometri nel tubo conico da 50 millilitri. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da 1 millilitro per macinare delicatamente il campione attraverso il colino.
Centrifugare la provetta per 5 minuti a 350 volte g ed eliminare il surnatante. Quindi lavare il pellet due volte con 10 millilitri di 1X HBSS. Risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di coltura completo di 60 micromolari di 6-tioguanina e, se lo si desidera, impiattare i campioni nelle piastre di coltura cellulare da 10 centimetri utilizzando uno schema di diluizione.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 5 giorni. Versare i terreni di coltura dalle piastre nell'apposito contenitore per i rifiuti. Per fissare le cellule, aggiungere 5 millilitri di metanolo non diluito a ciascuna piastra e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di far roteare il metanolo in modo che copra l'intera piastra.
Versare il metanolo dalle piastre nell'apposito contenitore per i rifiuti, quindi sciacquare ogni piastra con 5 millilitri di acqua distillata. Aggiungere 5 millilitri di blu di metilene allo 0,03% per piastra e incubarla per 5 minuti a temperatura ambiente, assicurandosi di agitare la soluzione di blu di metilene in modo che copra l'intera piastra. Versare il blu di metilene nell'apposito contenitore per rifiuti e sciacquare nuovamente ogni piastra con 5 millilitri di acqua distillata.
Capovolgere il piatto e tamponarlo contro un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Metti il piatto sul coperchio e lascialo asciugare all'aria per una notte. Le colonie metastatiche saranno blu. Una volta che le piastre si sono asciugate, possono essere conservate a temperatura ambiente a tempo indeterminato.