JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:26 min • July 8th, 2025
Le cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, sono cellule del sangue circolatorie con nuclei singoli e grandi, comprendenti linfociti B e T, cellule natural killer, monociti e cellule dendritiche. Le PBMC immagazzinano il glucosio in eccesso in forma polimerica come glicogeno - un polisaccaride ramificato - nel loro citoplasma.
Per rilevare la presenza di glicogeno nelle PBMC, preparare uno striscio uniforme di PBMC isolate su un vetrino. Trattare le cellule con formalina, una soluzione fissativa che lega in modo incrociato le biomolecole cellulari, preservando l'integrità strutturale delle PBMC.
Immergere parzialmente il vetrino in una soluzione di amilasi. Questo enzima entra nelle cellule e idrolizza il glicogeno nelle cellule trattate. Ciò si traduce in due distinte popolazioni cellulari: cellule ricche di glicogeno trattate con enzimi, carenti di glicogeno e non trattate con amilasi.
Sovrapponili con una soluzione acida periodica che converte ossidativamente i gruppi ossidrilici delle molecole di glicogeno in aldeidi.
Sciacquare il vetrino in acqua per arrestare la reazione di ossidazione e rimuovere l'eccesso di acido periodico. Trattare il vetrino con il reagente Schiff, che reagisce con i gruppi aldeidici del glicogeno periodico trattato con acido, generando un complesso insolubile di colore magenta.
Applicare i mezzi di montaggio per trattenere le celle durante l'imaging. Posizionare un vetrino coprioggetti per distribuire il supporto di montaggio su tutta la superficie del vetrino per una migliore visualizzazione. Immagina le cellule colorate.
Le cellule non trattate con amilasi contengono granuli di glicogeno magenta, assenti nelle cellule trattate con enzimi.
In questo passaggio, posizionare il vetrino su una superficie piana. Applicare 2 millilitri di soluzione di acido periodico sul campione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare più volte il vetrino con acqua distillata. Applicare 2 millilitri di reagente di Schiff sul vetrino e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Successivamente, lavare il vetrino con acqua distillata per 5 minuti, quindi lasciarlo asciugare all'aria. Quindi, applicare 100 microlitri di supporto di montaggio sul vetrino e coprirlo con un vetrino coprioggetti grande, oppure applicare 50 microlitri e utilizzare due piccoli vetrini coprioggetti. Successivamente, applica lo smalto trasparente sui bordi del vetrino coprioggetti. Lasciateli asciugare per una notte.
Quindi, ottenere immagini con il microscopio a luce binoculare utilizzando l'obiettivo 100X.