Colorazione blu di toluidina delle sezioni nervose periferiche: una tecnica per colorare le fibre nervose mieliniche per la visualizzazione della struttura nervosa periferica

I nervi periferici sono costituiti da assoni circondati da cellule di Schwann che avvolgono gli assoni con più strati di membrane cellulari ricche di lipidi, formando la guaina mielinica.

Per visualizzare i nervi periferici, iniziare con un vetrino che trasporta una sezione fissa del nervo periferico di ratto fissa, incorporata in resina e trattata con tetrossido di osmio. Le sezioni incorporate nella resina aiutano a mantenere la morfologia dei tessuti.

Il

trattamento con tetrossido di osmio provoca la deposizione di osmio metallico nello strato lipidico della guaina mielinica nel sito tissutale.

Pipettare la soluzione alcalina di blu di toluidina sulla sezione di tessuto. Asciugare il vetrino a una temperatura adeguata. Le condizioni alcaline e il calore facilitano la penetrazione del blu di toluidina attraverso la resina nella sezione di tessuto.

Il blu di toluidina, essendo un colorante cationico, si lega ai gruppi fosfato caricati negativamente sul DNA e si intercala anche tra le coppie di basi del DNA nei nuclei delle cellule di Schwann. Inoltre, il colorante si lega all'RNA nel citoplasma, al di fuori della guaina mielinica.

Aggiungere una soluzione di montaggio sulla sezione nervosa colorata e coprire con un vetrino coprioggetti per preparare il tessuto per l'imaging. Al microscopio ottico, gli strati della guaina mielinica appaiono neri con strutture definite di fibre nervose mieliniche dopo il trattamento con osmio, mentre gli assoni rimangono non colorati.

I nuclei delle cellule di Schwann e il citoplasma appaiono in diverse tonalità di blu a causa delle proprietà metacromatiche del colorante, facilitando la visualizzazione della morfologia degli assoni e del grado di mielinizzazione nei nervi periferici.

Per colorare le sezioni nervose, utilizzare una pipetta di plastica o un micro pipettatore per aggiungere una goccia di soluzione blu di toluidina sulla parte superiore delle sezioni nervose. Dopo 20-30 secondi, sciacquare via tutto l'eccesso di soluzione di blu di toluidina, immergendo delicatamente i vetrini in un barattolo di acqua deionizzata, ripetendo da 3 a 4 volte fino a quando le sezioni non sono chiare.

Asciugare i vetrini per almeno 15 minuti a 60 gradi Celsius o per una notte a temperatura ambiente. Dopo l'asciugatura, aggiungere un normale mezzo di montaggio e coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti. Infine, esaminare le sezioni montate al microscopio ottico. Si consiglia una lente a immersione in olio 100X per immagini dettagliate per calcolare i rapporti g.