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Per visualizzare le regioni della cartilagine e dell'osso in una sezione di tessuto, iniziare con un vetrino che trasporta una sottile sezione di tessuto embrionale di topo congelato di interesse.
Scongelare brevemente la criosezione e immergerla in un'adeguata concentrazione di etanolo per rimuovere il mezzo di crioinclusione. La fase di rimozione aiuta a prevenire l'allentamento del terreno, che potrebbe altrimenti influire sulla visualizzazione dei tessuti durante la colorazione. Inoltre, l'etanolo fissa il tessuto, mantenendone la morfologia e l'integrità.
Quindi, pipettare una soluzione di violetta cresyl sul tessuto. Il violetto di cresile, un colorante basico caricato positivamente, si lega alle frazioni polianioniche come i proteoglicani nella matrice del tessuto cartilagineo. Mentre, nei tessuti mineralizzati come le ossa, reagisce con gruppi caricati negativamente come i gruppi fosfato nella matrice ossea.
Essendo un colorante metacromatico, il cresil viola colora diverse regioni del tessuto con colori diversi dal colorante naturale in base alla sua interazione con diversi costituenti chimici all'interno di quelle regioni.
Ora, lava il fazzoletto in una concentrazione di etanolo adeguata per rimuovere la macchia in eccesso. Immergere il tessuto in concentrazioni crescenti di etanolo per sostituire l'acqua dal tessuto, disidratando il tessuto. Lavare il fazzoletto con xilene per spostare l'etanolo, rendendo il tessuto trasparente per la microscopia.
Al microscopio ottico, il tessuto cartilagineo appare magenta mentre il tessuto osseo appare marrone, facilitando la loro differenziazione l'uno dall'altro e dal tessuto circostante.
Preparare tre provette da centrifuga da 50 millilitri etichettate. Aggiungere 45 millilitri di etanolo all'80% in ogni tubo. Metti tre tubi sul ghiaccio. Metti un tubo contenente 45 millilitri di etanolo al 95% e un tubo contenente etanolo al 100% sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 45 millilitri di xilene a una provetta da centrifuga da 50 millilitri a temperatura ambiente.
Scongelare brevemente un vetrino della membrana PEN posizionandolo contro una mano guantata e lavarlo due volte per 30 secondi in ciascuna delle provette contenenti l'80% di etanolo con agitazione, per rimuovere il composto della temperatura di taglio ottimale. Quindi, adagiare il vetrino su un foglio di carta stagnola. Pipettare 0,8 millilitri di violetto cresil allo 0,1% in etanolo al 50% sul vetrino e colorare per 30 secondi.
Lavare il vetrino nella terza provetta contenente etanolo all'80% per 30 secondi. Disidratare il vetrino facendolo passare attraverso il tubo contenente etanolo al 95% per 30 secondi, il tubo contenente etanolo al 100% per 30 secondi e infine il tubo contenente xilene per 30 secondi. Successivamente, posiziona i vetrini su un tergicristallo delicato per 5 minuti per far defluire lo xilene e lasciare asciugare le sezioni.