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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:32 min • July 8th, 2025
In una popolazione eterogenea di cellule tumorali, il trattamento con un farmaco antitumorale ucciderebbe la maggior parte delle cellule, ma le cellule resistenti ai farmaci sopravvivono, con conseguente fallimento terapeutico.
Per determinare la proporzione di cellule resistenti ai farmaci, seminare una popolazione di cellule tumorali eterogenee in una piastra a più pozzetti. Incubare per facilitare l'adesione cellulare. Aggiungere una concentrazione crescente di una soluzione farmacologica antitumorale adatta.
L'interazione con le molecole del farmaco provoca la morte e, successivamente, il distacco delle cellule sensibili dalle piastre di coltura. Al contrario, le cellule resistenti ai farmaci sopravvivono e rimangono attaccate alla piastra.
Aspirare il terreno esaurito per rimuovere le cellule staccate. Aggiungere terreni freschi privi di farmaci e incubare la piastra in condizioni fisiologiche. Le cellule resistenti ai farmaci proliferano e formano colonie tumorali. Ora, aggiungi la soluzione colorante cristallovioletto alle colonie e incuba.
Il cristallovioletto, una colorazione di colore viola, permeabile alla membrana e caricata positivamente, entra nelle cellule e lega le proteine anioniche e il DNA, conferendo così un colore viola alle cellule.
Quindi, aggiungi etanolo per solubilizzare la macchia non reagita. Lavare per rimuovere le macchie in eccesso e asciugare la piastra all'aria.
Le colonie resistenti ai farmaci appaiono come punti viola. Conta il numero di colonie colorate in ogni pozzetto. Rappresenta la percentuale di vitalità cellulare su un grafico per determinare la proporzione di cellule tumorali resistenti ai farmaci a ciascuna concentrazione di farmaco.
In questa procedura, piastrate 2000 cellule, utilizzando 2 millilitri di terreno per pozzetto, nelle piastre a 6 pozzetti. Dopo 24 ore, aggiungere concentrazioni crescenti di Docetaxel per entrambe le linee cellulari DU145 e 22Rv1. Aggiungere DMSO solo a un pozzetto come controllo allo stesso volume utilizzato per la dose più alta di Docetaxel.
Dopo 72 ore, aspirare il terreno contenente il farmaco e aggiungere terreno fresco privo di Docetaxel. Incubare le piastre per una o due settimane, fino a quando le colonie sono visibili al microscopio.
Per colorare le colonie, lavarle delicatamente con 2 o 3 millilitri di PBS e incubarle con due o tre millilitri di soluzione di cristallovioletto per 20 minuti, all'interno della cappa di coltura tissutale o di una cappa aspirante. Successivamente, rimuovere la soluzione colorante e lavare le piastre con 2 o 3 millilitri di acqua. Quindi, rimuovere l'acqua e asciugare le piastre all'aria.
Scatta immagini digitali delle lastre per la rappresentazione della figura. Analizza il risultato visualizzando i pozzetti e contando manualmente le colonie con l'aiuto di un pennarello.