JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:37 min. • July 8th, 2025
Gli enociti larvali di Drosophila sono cellule specializzate che si attaccano sotto forma di grappoli discreti sulla superficie basale dell'epidermide laterale, lo strato superficiale della pelle. Questi enociti sono principalmente coinvolti nel metabolismo dei lipidi.
Durante la fame, questi enociti accumulano goccioline lipidiche in eccesso. Ogni gocciolina è costituita da un nucleo idrofobico di lipidi neutri, come i trigliceridi, e esteri del colesterolo, circondato da un monostrato di fosfolipidi.
Per visualizzare le goccioline lipidiche, prelevare una sezione sezionata dell'epidermide larvale di Drosophila con gli enociti attaccati. Trattare con un tampone di fissazione contenente paraformaldeide per reticolare le proteine cellulari come le proteasi e preservare l'integrità strutturale degli enociti. Rimuovere il tampone di fissaggio. Incubare al buio con un colorante fluorescente a base di BODIPY per evitare il fotosbiancamento.
Durante l'incubazione, il colorante non polare si diffonde attraverso la membrana cellulare degli enociti e attraversa il monostrato che circonda le goccioline lipidiche. L'idrofobicità delle molecole di colorante consente il loro movimento nel nucleo non polare delle goccioline lipidiche per legare i lipidi neutri.
Montare il campione su un vetrino, con gli enociti che toccano il vetrino microscopico per una visualizzazione chiara. Sigillare il campione con un vetrino coprioggetti e osservare al microscopio a fluorescenza.
Dopo l'eccitazione da parte della luce blu a una lunghezza d'onda di quattro novantatré nanometri, il colorante emette fluorescenza verde a cinquecentotre nanometri. Le macchie fluorescenti verdi confermano la presenza di goccioline lipidiche.
Per la colorazione delle goccioline lipidiche, incubare l'epidermide sezionata in un tampone di fissazione, per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore, seguito da una rapida risospensione in 1 millilitro di PBS. Quindi, lavare i campioni con tre lavaggi di 5 minuti in 1 millilitro di PBS per lavaggio, per rimuovere eventuali residui di fissativo.
Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i campioni epidermici con un'apposita sonda lipofila per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore. Durante l'incubazione, avvolgere le provette dei campioni in un foglio di alluminio per proteggere i tessuti dalla luce e lavare i campioni tre volte in 1 millilitro di PBS per 10 minuti per lavaggio.
Per visualizzare gli enociti, trasferire ciascun campione di epidermide in 6 microlitri di terreno di montaggio su un vetrino da microscopio pulito. Regolare l'orientamento del tessuto in modo che la superficie interna contenente gli enociti tocchi la parte inferiore del vetrino. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sull'epidermide e sigillare i bordi con smalto trasparente. Quando lo smalto si è asciugato, eseguire l'imaging dei campioni su un microscopio confocale a un ingrandimento di 63X con le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate.