JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:40 min • July 8th, 2025
Durante l'ischemia cerebrale, l'alterazione del flusso sanguigno al cervello riduce l'apporto di ossigeno e nutrienti ai tessuti, causando danni cerebrali. Dopo una breve ischemia, quando il flusso sanguigno al cervello viene ripristinato, la riperfusione con un aumento dell'apporto di ossigeno provoca una sovrapproduzione di specie ioniche reattive, con conseguente danno ossidativo ai tessuti, noto come danno da ischemia-riperfusione.
Per valutare il danno cerebrale a seguito di danno da ischemia-riperfusione in un modello di ratto, in primo luogo, prelevare il cervello di ratto. Sciacquare in un tampone freddo per rimuovere detriti e sangue. Sezionare il cervello per ottenere fette coronali degli spessori desiderati. Trasferire con cura le fette in un vassoio contenente tampone, con le superfici anteriori rivolte verso l'alto, per la successiva colorazione.
Aggiungere una soluzione di cloruro caldo di trifenil tetrazolio, TTC, un colorante redox solubile in acqua, sulle fette del cervello. Incubare in condizioni di oscurità, poiché il TTC è sensibile alla luce. La TTC entra nelle cellule all'interno della sezione tissutale.
Nelle cellule viventi, l'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi attivo in presenza di cofattori riduce il TTC, incolore quando ossidato, in formazan rosso insolubile in acqua, colorando le cellule vitali di rosso intenso. Tuttavia, le cellule necrotiche mancano di attività deidrogenasi; quindi, il TTC rimane in forma ossidata, colorando le cellule di bianco.
Dopo l'incubazione, trasferire le fette di cervello in un vassoio di imaging. Separare gli emisferi nel piano sagittale. Immaginate le fette di cervello.
Il tessuto sano appare rosso, mentre il tessuto danneggiato appare bianco, differenziando il tessuto necrotico dal tessuto vitale e consentendo la stima dell'entità del danno tissutale.
Dopo aver rimosso il cervello, compreso il tronco encefalico, dal cranio, posizionare il cervello, con il lato ventrale rivolto verso l'alto, nella matrice cerebrale. A seconda del peso degli animali, scegli la dimensione corretta della matrice cerebrale in acciaio inossidabile. Usando le lame, restringi le parti frontali e caudali del cervello. Quindi, inserire le lame parzialmente nei canali tra la prima e l'ultima lame.
Quando tutte le lame sono inserite e disposte in parallelo, premere contemporaneamente tutte le lame con il palmo della mano per tagliare il cervello in fette coronali di 2 millimetri. Quindi, afferra saldamente le lame lungo i lati con due dita e rimuovile insieme al cervello tagliato dalla matrice. Disponi le fette di cervello una per una in un vassoio, assicurandoti che la superficie anteriore di ogni fetta sia sempre rivolta verso l'alto.
Quindi, versare la soluzione calda di cloruro di trifenil tetrazolio all'1% e PBS sulle fette di cervello e incubare per 8 minuti a 37 gradi Celsius al buio. Dopo l'incubazione, trasferisci le fette di cervello in un vassoio di plastica blu per catturare le immagini. Disponi le fette di cervello in ordine sequenziale dalla parte frontale a quella caudale e usa un bisturi per separare gli emisferi sul piano sagittale.