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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:08 min • July 8th, 2025
Gli osteoclasti sono grandi cellule multinucleate a forma di cupola che si trovano sulla superficie ossea. Queste cellule contengono numerosi granuli citoplasmatici ricchi di fosfatasi acida resistente ai tartrati, o TRAP, un enzima metalloproteico secreto dal bordo arruffato degli osteoclasti nel tessuto osseo. Questo enzima digerisce la matrice extracellulare e dissolve i cristalli minerali, facilitando il riassorbimento osseo.
Per rilevare i granuli TRAP come marcatori citochimici degli osteoclasti, prendere una piastra di coltura contenente osteoclasti aderenti. Aggiungere la soluzione colorante TRAP alle cellule. Questa soluzione comprende il substrato - un derivato del naftolo contenente fosfato e l'acido tartarico in un tampone integrato con un sale di diazonio.
Aggiungere acido acetico a questa soluzione per mantenere il pH acido necessario per la colorazione TRAP. Incubare le cellule al buio a temperatura fisiologica per un'attività ottimale dell'enzima TRAP.
La soluzione colorante entra negli osteoclasti, dove l'acido tartarico inibisce l'attività idrolizzante delle fosfatasi acide sensibili ai tartrati in altre cellule.
Allo stesso tempo, TRAP idrolizza il substrato aggiunto per rimuovere il suo gruppo fosfato. Il substrato idrolizzato si accoppia con un sale di diazonio della soluzione colorante per formare un complesso colorante insolubile di colore marrone. Questo complesso precipita sotto forma di granuli nei siti di attività enzimatica.
Immagine delle cellule al microscopio. La deposizione di granuli di colorante marrone rossiccio all'interno del citoplasma conferma la presenza di osteoclasti contenenti TRAP nella coltura.
In questa fase, aspirare il terreno e lavare delicatamente il campione tre volte con 1X PBS. Quindi, fissare le cellule in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione fissa per 30 secondi a temperatura ambiente.
Dopo il fissaggio, aspirare la soluzione di fissaggio e lavare delicatamente le cellule tre volte con acqua deionizzata, preriscaldata a 37 gradi Celsius. Quindi, aspirare l'acqua deionizzata e aggiungere 100 microlitri di colorante TRAP in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
Metti la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti e proteggila dalla luce. Dopo la colorazione, aspirare la macchia TRAP e lavare delicatamente tre volte con acqua deionizzata. Successivamente, visualizzare gli osteoclasti in un microscopio invertito con un ingrandimento di 40X.