Colorazione con argento di glicosaminoglicani solfatati: un metodo di colorazione per la visualizzazione di glicosaminoglicani solfatati in gel di poliacrilammide

I glicosaminoglicani solfatati, GAG, sono polisaccaridi lineari lunghi, caricati negativamente, con catene unitarie disaccaridiche ripetute solfatate in posizioni distinte, esistenti in lunghezze variabili.

Per visualizzare GAG solfatati isolati di interesse che differiscono per lunghezza della catena in un gel di poliacrilammide dopo l'elettroforesi, rimuovere con cura il gel dalla sua cassetta. Risciacquare con acqua deionizzata, rimuovendo i pezzi di gel attaccati che potrebbero interferire con la colorazione.

Trattare con una soluzione acida di blu di Alciano. In condizioni acide, il blu di Alcian, un colorante cationico polivalente con un atomo di rame al centro, interagisce specificamente con i GAG solfatati caricati negativamente tramite interazioni ioniche, formando un complesso insolubile in acqua di colore blu intenso.

Lavare il gel con acqua deionizzata e metanolo, rimuovendo ogni macchia residua. Incubare il gel con una soluzione alcalina di nitrato d'argento. In condizioni alcaline, i GAG solfatati legati al blu di Alcia forniscono siti per gli ioni d'argento caricati positivamente per legarsi e formare complessi.

Trattare il gel in una soluzione di sviluppo contenente formaldeide e acido citrico. L'acido citrico abbassa il pH locale per un'attività ottimale della formaldeide, che riduce gli ioni d'argento ad argento metallico insolubile all'interno dei frammenti GAG solfatati, amplificando il segnale del blu di Alcian.

Aggiungere una soluzione di arresto per abbassare il pH, prevenendo la riduzione degli ioni d'argento per una colorazione di fondo minima. Ora, immagina il gel.

bande di frammenti di GAG solfatate colorate con blu-argento di Alciano appaiono marrone scuro o nero, consentendo la visualizzazione e la determinazione ad alta sensibilità delle lunghezze delle catene polimeriche GAG isolate.

Una volta completata la corsa, smontare la cassetta ed estrarre con cura il gel in un contenitore grande e pulito riempito con acqua deionizzata e filtrata. Quindi, scartare l'acqua e colorare il gel con la soluzione colorante blu Alcian per cinque minuti. Scartare la macchia blu di Alcian e lavare rapidamente due o tre volte con acqua deionizzata e filtrata fino a rimuovere la maggior parte della soluzione colorante di blu di Alcian.

Colorare il gel con una soluzione colorante al nitrato d'argento in un contenitore fresco e pulito per 30 minuti. Quindi lavare due o tre volte per 30 minuti ciascuna in acqua filtrata deionizzata, per rimuovere completamente la soluzione di colorazione dell'argento. Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione di sviluppo.

Osservare attentamente il gel per la comparsa di bande. A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti. Non appena le bande desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione di sviluppo e lavare brevemente il gel con la soluzione di arresto.