Colorazione di Giemsa per il saggio di formazione di colonie: una procedura di colorazione in vitro per valutare la capacità proliferativa delle cellule staminali mesenchimali

I saggi di formazione di colonie misurano la capacità proliferativa delle cellule di crescere in colonie.

In primo luogo, seminare una sospensione cellulare derivata dal midollo osseo comprendente eritrociti e cellule mononucleate, comprese le cellule staminali mesenchimali o MSC, in terreni su una piastra di coltura e incubare. Le MSC aderiscono al fondo della piastra mentre gli eritrociti e le cellule mononucleate rimangono in sospensione e vengono scartate.

Aggiungere nuovi terreni contenenti fattori di crescita per supportare la sopravvivenza delle MSC. A seconda del loro potenziale proliferativo individuale, le MSC si replicano per formare colonie.

Quindi, trattare le colonie con metanolo. Il metanolo permeabilizza le cellule, sposta l'acqua dall'ambiente intracellulare e denatura le proteine, preservando l'architettura cellulare.

Incubare le colonie fissate con la soluzione colorante Giemsa, una miscela di prodotti di ossidazione del blu di metilene, principalmente l'azzurro B, un colorante basico, e l'eosina Y, un colorante acido. Dopo la diffusione nelle cellule, i dimeri B azzurri caricati positivamente si legano tramite intercalazione al DNA caricato negativamente nel nucleo, conferendo una colorazione blu.

I monomeri Y dell'eosina caricati negativamente interagiscono quindi con le cariche positive non neutralizzate sui dimeri azzurri B legati, formando un "complesso eosina-Y-azzurro-B", cambiando la colorazione del DNA colorato di blu in viola.

Nel citoplasma ricco di ribosomi, l'azzurro B si lega all'RNA caricato negativamente, ma la ridotta penetrazione dell'eosina Y nei ribosomi ad alta densità, previene la formazione del complesso eosina-Y-azzurro-B, colorando l'RNA di blu.

Ora, lava la piastra con un tampone per rimuovere la macchia in eccesso e asciugala all'aria. Conta il numero di colonie, che appaiono come gruppi di cellule con nuclei viola e citoplasma blu.

Per eseguire il test UFC, preparare 10 millilitri di soluzione di Giemsa per piatto, utilizzando acqua sterile per diluire la soluzione madre da 1 a 10. Rimuovere il terreno dalla piastra di coltura cellulare e utilizzare il PBS per lavare accuratamente le cellule.

Con metanolo puro, fissare le celle a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi scartare il metanolo e aggiungere la soluzione di Giemsa. Incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare il PBS per lavare le cellule due volte. Quindi, asciugare il piatto all'aria con la testa su un tovagliolo di carta. Con un pennarello sul retro della piastra, contare manualmente le colonie.