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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:42 min. • July 8th, 2025
I proteoglicani sono composti da una proteina centrale legata in modo covalente a catene di glicosaminoglicani solfatati.
Per visualizzare i proteoglicani, iniziare con scaffold a base di collagene - il substrato polimerico poroso - e seminare su di essi la sospensione di cellule staminali mesenchimali, o MSC. Ciò fornisce un supporto strutturale alle MSC e consente loro di crescere in superficie e all'interno delle cavità degli scaffelli.
Trattare i costrutti in un terreno di differenziazione condrogenica contenente fattori di crescita trasformanti che guidano la trasformazione delle MSC in condrociti maturi - cellule cartilaginose. I condrociti maturi secernono proteoglicani che formano una rete con il collagene nell'impalcatura.
Prendi una sezione preparata dal costrutto carico di condrociti. Aggiungere una soluzione acida di colorante blu di alcia integrata con cloridrato di guanidio e incubare. Durante l'incubazione, la guanidina cloridrato nella soluzione colorante dissocia tutti gli aggregati di proteoglicani per una migliore colorazione.
Successivamente, i glicosaminoglicani solfatati caricati negativamente dai proteoglicani si legano alle molecole di colorante blu alciano caricate positivamente contenenti rame, dando luogo a depositi blu.
Successivamente, immergere il vetrino in una soluzione decolorante contenente cloruro di magnesio. Gli ioni magnesio competono con le molecole di colorante caricate positivamente per i siti di legame sui glicosaminoglicani, prevenendo così la sovracolorazione.
Immagina la sezione. La colorazione blu conferma la presenza di proteoglicani nel campione
Per effettuare la differenziazione condrogenica da un dispositivo medico a forma di spugna costituito da collagene liofilizzato di tipo 1, tagliare dei cubetti di 3 millimetri per lato. Seminare le MSC sopra i cubi ad una concentrazione di 4 x 106 cellule/ml.
Dopo aver lasciato che le cellule aderiscano ai cubi per 30 minuti a temperatura ambiente, mantenere i costrutti di collagene MSC in mezzo condrogenico, come elencato nel protocollo di testo. Aggiungere la soluzione di blu di Alcian allo 0,4% alle sezioni e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno successivo, utilizzare il 40% di DMSO e 0,05 molari di cloruro di magnesio per lavare le cellule per 30 minuti prima di utilizzare il rosso nucleare veloce per controcolorare le cellule.