JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:03 min • July 8th, 2025
Nella ruggine del caffè, le spore di Hemileia vastatrix - un fungo patogeno - si posano sulla superficie della pianta e sviluppano un tubo di germinazione, avviando così un'infezione attraverso le ife.
Queste ife si diffondono all'interno del tessuto e invadono le cellule vegetali attraverso strutture specializzate simili a dita chiamate haustoria, che assorbono i nutrienti delle piante. Gli haustoria secernono anche molecole effettrici che sono riconosciute dalle proteine di resistenza della pianta, portando all'incapsulamento ricco di pectina dell'haustoria per limitare l'infezione.
Per visualizzare questa interazione, inizia con una sezione di foglie di caffè infetta ultrasottile, incorporata nella resina. Ora, trattare il campione con lattofenolo blu di cotone, una colorazione istologica che comprende fenolo, acido lattico, glicerolo e blu di cotone. Riscaldare brevemente il vetrino.
Man mano che i componenti del colorante penetrano nei tessuti, il fenolo elimina tutti gli organismi vivi, mentre l'acido lattico e il glicerolo aiutano a preservare l'architettura cellulare. Contemporaneamente, le molecole di blu di cotone si legano alle frazioni di chitina nella parete cellulare fungina e la colorano di blu.
Lavare il campione con acqua distillata. Quindi, trattare il campione con colorante rosso rutenio.
Le molecole di rutenio caricate positivamente si legano ai polisaccaridi caricati negativamente nella parete cellulare vegetale ricca di pectina e la colorano di rosso. Anche in questo caso, lavare il vetrino e visualizzarlo al microscopio.
La parete cellulare delle piante ricca di pectina appare rossa, incapsulando l'austoria blu che si estende dalle ife fungine blu.
Tagliare il blocco in sezioni di 5 micrometri di spessore utilizzando un microtomo rotativo dotato di lame in acciaio da 8 centimetri. Posizionare le sezioni su vetrini ricoperti di acqua distillata, quindi trasferire i vetrini su una piastra calda ad asciugare a 40 gradi Celsius e favorire l'adesione delle sezioni ai vetrini.
Dopo l'asciugatura, etichettare i vetrini con il nome del riferimento del blocco e il numero del vetrino. Coprire le sezioni con 2 millilitri di blu di cotone al 5% in lattofenolo e scaldarle su una piastra calda a 45 gradi Celsius per cinque minuti.
Rimuovere il colorante in eccesso lavando tre volte il vetrino in un becher riempito con acqua distillata. Colorarlo con 2 millilitri di rosso rutenio allo 0,01% in acqua per un minuto.
Rimuovere il colorante in eccesso lavando tre volte il vetrino in un becher riempito con acqua distillata. Mettere una goccia di acqua distillata sulle sezioni e coprire le sezioni con un vetrino coprioggetti per eseguire l'analisi al microscopio ottico.