JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:48 min. • July 8th, 2025
L'aterosclerosi si verifica a causa dell'accumulo di lipoproteine nel rivestimento interno delle arterie, con conseguente accumulo di placca, ispessimento e restringimento delle arterie e riduzione del flusso sanguigno.
Le placche sono costituite da un cappuccio fibroso con cellule muscolari lisce e matrice extracellulare, che racchiude un nucleo composto da lipoproteine a bassa densità, LDL - particelle sferiche con un nucleo idrofobico di esteri del colesterolo e trigliceridi, circondato da uno strato esterno fosfolipidico - insieme a cellule infiammatorie.
Per visualizzare le placche aterosclerotiche ricche di lipidi, procuratevi un arco aortico di topo appena raccolto. Trasferitelo su una piattaforma personalizzata con sfondo scuro per migliorare il contrasto durante l'imaging di un'ampia area. Aggiungere un tampone per prevenire la disidratazione dei tessuti.
Rimuovere il tessuto adiposo perivascolare che circonda l'arco aortico per evitare false macchie di fondo. Incidere l'aorta e i suoi rami longitudinalmente attraverso il lume per esporre la superficie più interna con accumulo di placca aterosclerotica.
Fissare l'arco aortico aperto sulla piattaforma e incubare in etanolo. L'etanolo sposta l'acqua dai tessuti, inattivando le proteine e preservando l'architettura dei tessuti.
Trattare con la colorazione Sudan IV solubilizzata in solventi organici. All'interno della placca, Sudan IV, un colorante diazoico liposolubile con un'elevata affinità per i trigliceridi e gli esteri del colesterolo delle lipoproteine, passa dalla fase di solvente organico e si lega al nucleo idrofobico dei lipidi delle LDL, formando complessi stabili. Lavare via la macchia in eccesso con etanolo.
Al microscopio, le placche aterosclerotiche ricche di lipidi colorate appaiono rosso-arancio, mentre le aree non placcate appaiono pallide.
Per preparare un letto di spillatura per l'analisi en face, piegare un segmento di pellicola di cera di paraffina 8 volte per creare una superficie piatta di 25 x 25 millimetri e avvolgere il nastro isolante elettrico nero attorno alla pellicola per creare uno sfondo scuro per l'aorta.
Posiziona un'etichetta sul retro del letto di spillatura e usa una matita di piombo per annotare il numero di identificazione del mouse. Trasferisci l'arco aortico sul letto di spillo e aggiungi una goccia di PBS al tessuto. Utilizzando uno stereomicroscopio, pulire l'aorta dal restante tessuto adiposo periavventiziale e utilizzare le forbici di Vannas e le pinze Dumont per staccare delicatamente tutto il tessuto adiposo circostante senza manipolare o danneggiare l'aorta.
Quindi, introdurre le forbici di Vannas nel lume aortico per esporre la superficie intimale. Iniziare a tagliare la curvatura esterna dell'arco ascendente in direzione distale continuando a tagliare i rami, compresa l'arteria brachiocefalica, e risparmiando la parte dorsale della regione toracica discendente.
Per visualizzare la superficie intimale, tagliare la curvatura minore e aprire l'aorta. Utilizzando un portaaghi micro Castroviejo, fissare l'arco aperto al letto di spillo con l'estremità smussata degli spilli per insetti minuziosi senza allungare il campione, piegando delicatamente i perni lontano dal campione, poiché il tessuto è tenuto in posizione. Quindi, conservare l'arco appuntato a faccia in giù in una capsula di Petri di PBS a 4 gradi Celsius.
Per la colorazione Sudan IV, sciacquare il campione per 5 minuti in una piastra di Petri di etanolo al 70% con l'arco rivolto verso il basso, prima di trasferire il campione in una piastra di soluzione di lavoro Sudan IV per 7 minuti.
Al termine dell'incubazione, sciacquare il campione con due lavaggi di 3 minuti in etanolo all'80% per decolorare la normale superficie intimale, seguiti da un risciacquo finale in PBS, prima di rimettere il tessuto nella sua piastra di Petri originale. Quindi, acquisire micrografie sotto uno stereomicroscopio collegato a una fotocamera digitale con un ingrandimento di 10X, ottenendo immagini dell'arco appuntato immerso in PBS, utilizzando piccoli pesi metallici per tenere il letto di spillo sul fondo della capsula di Petri.