JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Per la cromatografia a scambio anionico di una proteina di interesse da un lisato proteico batterico dializzato, aggiungere un tampone legante per ridurre la viscosità del lisato ed evitare che ostruisca la colonna cromatografica.
Gli agenti chelanti nel tampone legano i cationi bivalenti, inibendo l'attività della proteasi e prevenendo la degradazione delle proteine. Inoltre, il tampone con pH superiore al punto isoelettrico della proteina bersaglio, pI, il pH al quale la proteina non ha carica netta, fa sì che gli ioni ossidrile caricati negativamente in eccesso neutralizzino i gruppi amminici caricati positivamente della proteina, rendendo la superficie della proteina carica negativa.
Assemblare la colonna per cromatografia a scambio anionico contenente una fase stazionaria reticolata a base di agarosio con gruppi amminici quaternari caricati positivamente. Aggiungere il tampone di legame per preparare la colonna alla massima interazione proteica durante il caricamento del campione. Caricare il lisato batterico diluito.
Le proteine bersaglio caricate negativamente si legano più strettamente ai gruppi caricati positivamente nella colonna rispetto alle proteine meno caricate negativamente.
Eseguire il tampone di legame per rimuovere le proteine caricate positivamente non legate dalla colonna. Far passare un tampone di eluizione attraverso la colonna, aumentando gradualmente la concentrazione di sale. A basse concentrazioni di sale, gli ioni negativi competono con le proteine debolmente legate per legarsi alla colonna, causandone l'eluizione.
Successivamente, il tampone ad alta concentrazione di sale sposta le proteine di interesse strettamente legate con un tempo di ritenzione più lungo, eluendo le proteine bersaglio. Le proteine bersaglio raccolte possono essere utilizzate per ulteriori analisi.
Avviare l'FPLC con la manutenzione generale. Collegare i tamponi per colonne AIEX-A e AIEX-B alle valvole tampone e la colonna contenente resina a scambio anionico alle porte per colonne dell'FPLC. Regolare di conseguenza i parametri cromatografici generali.
Avviare il programma AIEX nel software FPLC e scegliere il volume di equilibratura per il tampone A. Successivamente, caricare il campione sulla colonna ed eluire le proteine con un gradiente lineare da 0% a 100% di tampone ad alto contenuto di sale. Raccogliere frazioni di 2 millilitri durante l'eluizione.
Analizza le frazioni eluite dopo aver terminato la corsa.