JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:59 min. • July 8th, 2025
Per la cromatografia a scambio anionico di una proteina di interesse da un lisato proteico batterico dializzato, aggiungere un tampone legante per ridurre la viscosità del lisato ed evitare che ostruisca la colonna cromatografica.
Gli agenti chelanti nel tampone legano i cationi bivalenti, inibendo l'attività della proteasi e prevenendo la degradazione delle proteine. Inoltre, il tampone con pH superiore al punto isoelettrico della proteina bersaglio, pI, il pH al quale la proteina non ha carica netta, fa sì che gli ioni ossidrile caricati negativamente in eccesso neutralizzino i gruppi amminici caricati positivamente della proteina, rendendo la superficie della proteina carica negativa.
Assemblare la colonna per cromatografia a scambio anionico contenente una fase stazionaria reticolata a base di agarosio con gruppi amminici quaternari caricati positivamente. Aggiungere il tampone di legame per preparare la colonna alla massima interazione proteica durante il caricamento del campione. Caricare il lisato batterico diluito.
Le proteine bersaglio caricate negativamente si legano più strettamente ai gruppi caricati positivamente nella colonna rispetto alle proteine meno caricate negat
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