JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:22 min. • July 8th, 2025
La cromatografia di interazione idrofobica calcio-dipendente è una tecnica per separare le proteine leganti il calcio da altre proteine non leganti il calcio in un campione.
Per iniziare, prendere una colonna cromatografica preassemblata contenente una matrice di perle di agarosio reticolate derivatizzate con gruppi fenilici idrofobici per facilitare le interazioni con le proteine bersaglio. Equilibrarlo con un tampone legante contenente un'altissima concentrazione di ioni calcio per la massima interazione tra resina e proteina bersaglio durante il successivo caricamento del campione.
Prelevare un campione contenente la miscela proteica dializzata e integrarlo con una concentrazione di cloruro di calcio uguale a quella utilizzata nel tampone legante per l'equilibrio della colonna. In questo modo si massimizza il legame delle proteine alla colonna.
Gli ioni calcio si legano a specifiche proteine nel lisato, inducendo un cambiamento conformazionale in queste molecole proteiche esponendo le loro regioni idrofobiche.
Filtrare la miscela per separare le impurità e gli aggregati per evitare che ostruiscano la colonna. Caricare questo filtrato nella colonna pre-equilibrata. Le proteine con regioni idrofobiche esposte interagiscono con i corrispondenti gruppi fenilici idrofobici della resina.
Lavare utilizzando il tampone legante contenente sale per rimuovere le proteine non legate e migliorare la purezza del campione nelle fasi successive. Far passare il tampone di eluizione privo di cloruro di calcio contenente EDTA, un chelante bivalente, attraverso la colonna.
Quando l'EDTA chela gli ioni calcio, le interazioni idrofobiche tra la proteina bersaglio e la resina vengono interrotte. Le proteine bersaglio diventano mobili ed eluiscono dalla colonna.
Per continuare la purificazione delle proteine, dopo la dialisi proteica, aggiungere cloruro di calcio al campione fino a una concentrazione finale di 25 millimolari, che faciliterà il legame del S100A12 alla resina nella fase successiva. Quindi, filtrare il campione attraverso un filtro con una dimensione della colata di 0,45 micron.
Equilibrare tamponi HIC e campioni a 4 gradi Celsius. Successivamente, collegare i buffer della colonna HIC-A e B e la colonna al sistema e regolare i parametri.
Avviare il metodo per equilibrare la colonna con volumi di colonna da 1 a 2 di tampone HIC-A e caricare il campione e il "blocco del campione non legato di lavaggio" quando il segnale UV raggiunge nuovamente il livello di base.
Quindi, iniziare l'eluizione con un tampone EDTA contenente chelante del calcio. Raccogliere 2 millilitri di frazioni di picco durante l'eluizione.