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La parete cellulare micobatterica contiene diverse varianti di acidi micolici: acidi grassi a catena lunga con catene alfa conservate. Esistono differenze strutturali nelle loro catene beta, con conseguenti variazioni nella polarità di diversi acidi micolici.
Per separare le varianti utilizzando la cromatografia su strato sottile, o TLC - una tecnica di cromatografia liquida - prendere i lipidi della parete cellulare micobatterica nel solvente organico desiderato. Individuare i lipidi vicino alla base di una piastra TLC prerivestita con un sottile strato di materiale adsorbente, che funge da fase stazionaria.
Posizionare la piastra all'interno di un barattolo contenente un solvente organico - la fase mobile - assicurandosi che il livello del liquido sia al di sotto delle macchie del campione per prevenire la diffusione prematura degli acidi micolici.
Durante la corsa, la fase mobile sale attraverso i minuscoli pori dello strato adsorbente sulla piastra attraverso l'azione capillare. Alla fine, gli acidi micolici si dissolvono nel solvente e viaggiano verso l'alto.
Le varianti più polari dell'acido micolico vengono adsorbite transitoriamente dalla fase stazionaria polare attraverso forze intermolecolari, ostacolando il loro movimento verso l'alto. Meno acidi micolici polari rimangono nella fase mobile non polare e migrano ulteriormente.
Le differenze nella migrazione fanno sì che le varianti dell'acido micolico si separino in bande discrete.
Al termine, spruzzare la piastra essiccata con una colorazione con acido fosfomolibdico. Scaldare la piastra per ridurre la macchia in presenza dei lipidi, conferendo un colore verde scuro alle bande.
Per analizzare i campioni mediante TLC, coprire una parete della camera TLC con un pezzo di carta da filtro. Aggiungere la vaselina sugli angoli della camera per sigillare la camera. Decantare la miscela di solvente sulla carta da filtro e aggiungere il volume rimanente del solvente sul fondo della camera TLC. Chiudere la camera TLC per almeno 20 minuti per saturarla
Nel frattempo, sciogliere i lipidi nel tubo di vetro in 200-1.000 microlitri di cloroformio e utilizzare un tubo di vetro capillare per applicare 10 microlitri della sospensione lipidico-cloroformio direttamente sulla piastra TLC. Dopo aver lasciato asciugare il campione per cinque minuti, inserire la piastra nella camera TLC satura e lasciare che la fase mobile scorra attraverso la TLC.
Quando il solvente raggiunge 1 centimetro dall'estremità superiore della piastra, posizionare la piastra sotto flusso laminare fino a quando la silice non è completamente asciugata. Quindi, spruzzare la piastra essiccata con 15-20 millilitri di acido molibdatofosforico idrato al 10% in etanolo, fino a quando la piastra non diventa giallo brillante, e riscaldare la piastra per due-cinque minuti a 120 gradi Celsius.