Purificazione del baculovirus basata sulla cromatografia di affinità con eparina: una tecnica per isolare il baculovirus dal surnatante delle cellule di insetto

I baculovirus - virus a DNA a doppio filamento - sono circondati da un involucro contenente le principali glicoproteine virali, come la GP64.

Per isolare i baculovirus da un surnatante di coltura cellulare contenente detriti cellulari e proteine contaminanti, assemblare una colonna cromatografica di affinità con eparina contenente una matrice di perle di agarosio reticolate. Queste perle sono accoppiate all'eparina, un polisaccaride lineare con gruppi solfato, che conferiscono una carica negativa alla catena dell'eparina.

Equilibrare la colonna con un tampone di lavaggio a pH neutro e forza ionica ottimale per fornire condizioni favorevoli per le massime interazioni tra baculovirus ed eparina durante il carico del surnatante. Caricare il surnatante contenente baculovirus sulla colonna.

Gli amminoacidi basici del baculovirus GP64 facilitano le interazioni elettrostatiche aspecifiche con l'eparina caricata negativamente e si legano strettamente alla colonna, a differenza dei contaminanti che si legano liberamente. Sciacquare la colonna con un tampone di lavaggio, rimuovendo le proteine e i detriti contaminanti non legati e debolmente legati.

Far passare un tampone di eluizione con una forza ionica più elevata rispetto al tampone di lavaggio attraverso la colonna. La maggiore forza ionica interrompe le interazioni elettrostatiche baculovirus-eparina, dissociando ed eluendo i baculovirus dalla colonna.

Raccogliere l'eluato contenente baculovirus nel flusso continuo. Diluire immediatamente la sospensione di baculovirus con un tampone contenente concentrazioni fisiologiche di sale, prevenendo l'inattivazione del virus. I baculovirus isolati possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

Impostare il sistema cromatografico posizionando la linea del tampone di lavaggio dalla porta di ingresso A1 in un flacone contenente almeno 500 millilitri di tampone di lavaggio. Utilizzare la porta di ingresso del tampone A2 per caricare il tampone di eluizione.

Inserire diverse provette coniche da 50 millilitri nel collettore di frazioni per raccogliere il surnatante del baculovirus passante della colonna, il tampone di lavaggio e il baculovirus eluito. Equilibrare la colonna di eparina con cinque volumi di colonna da 7,9 millilitri di tampone di lavaggio, a una portata lineare di 7 millilitri al minuto.

Caricare 250 millilitri di surnatante di baculovirus sulla colonna di eparina, utilizzando la pompa di campionamento della porta di ingresso del campione a una portata lineare di 2 millilitri al minuto. Quindi, far scorrere 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio attraverso la colonna di eparina a una velocità di flusso lineare di 2 millilitri al minuto, fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta non è tornata alla linea di base e si è stabilizzata.

Diluire le particelle di baculovirus dalla colonna di eparina con cinque volumi di tampone di eluizione a una velocità di flusso lineare di 4 millilitri al minuto. Osservare un picco di eluizione acuta della proteina sul cromatogramma quando le particelle di baculovirus si dissociano dalla colonna di eparina.

Dopo l'eluizione, diluire immediatamente il surnatante del baculovirus eluito 10 volte utilizzando un tampone fosfato di sodio da 20 millimolari per prevenire l'inattivazione delle particelle di baculovirus dallo shock osmotico durante la successiva centrifugazione.