Cromatografia liquida con interazione idrofila: una tecnica per separare gli analiti polari idrofili utilizzando perle idrofile

La cromatografia liquida con interazione idrofila, HILIC, è una tecnica per separare i composti polari idrofili in base al loro grado di polarità. Iniziare installando una colonna HILIC piena di perle idrofile che trasportano gruppi funzionali polari.

Innanzitutto, condizionare la colonna utilizzando un tampone di equilibrio e una fase mobile, una miscela di solvente organico e acqua. Le molecole tampone stabilizzano il pH, mentre il solvente organico satura la colonna. Le molecole d'acqua si immobilizzano e creano uno strato acquoso sopra le perle idrofile.

Caricare il campione contenente una miscela di glicani - composti polari idrofili - etichettati con un'etichetta fluorescente. Far scorrere il campione utilizzando un gradiente di fase mobile attraverso la colonna a una velocità di flusso ottimale.

Mentre il campione si muove lungo la fase mobile idrofobica, i glicani migrano nello strato acquoso, lasciando dietro di sé le impurità. Successivamente, i glicani si spostano verso i gruppi funzionali polari sulle perline. Qui, più glicani polari si legano fortemente, mentre quelli meno polari si legano liberamente.

Quando l'idrofobicità della fase mobile diminuisce, i glicani debolmente legati con meno polarità e un tempo di ritenzione più breve eluiscono per primi. Al contrario, i glicani fortemente legati con polarità più elevata e un tempo di ritenzione più lungo eluiscono per ultimi.

Infine, un rivelatore rileva il segnale fluorescente delle frazioni eluite, corrispondente ai picchi standard dei glicani nel cromatogramma.

Innanzitutto, apri il software per controllare le fasi mobili. Lavare gli strumenti UPLC con il 50% di solvente B e il 50% di solvente C alla portata di 0,2 millilitri al minuto, per 30 minuti. Quindi lavare, con il 25% di solvente A e il 75% di solvente B a una velocità di flusso di 0,2 millilitri al minuto, per 20 minuti, quindi, a una velocità di flusso di 0,4 millilitri al minuto.

Sciogliere gli N-glicani marcati con 25 microlitri di una miscela di acetonitrile al 100% e acqua ultrapura in un rapporto 2:1 (volume/volume). Quindi, centrifugare a 134 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius e utilizzare un tubo di trasmissione per caricare 10 microlitri di surnatante negli strumenti UPLC.

Separare gli N-glicani marcati a una velocità di flusso di 0,4 millilitri al minuto, con un gradiente lineare dal 75% al 62% di acetonitrile per 25 minuti. Quindi, eseguire un'esecuzione analitica mediante scala di calibrazione destrano/colonna glicopeptidica su un UPLC a 60 gradi Celsius.

Rileva la fluorescenza dell'N-glicano a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 330 nanometri e 420 nanometri.