Separazione basata sulla cromatografia ad esclusione dimensionale di vescicole extracellulari batteriche: una tecnica per separare la popolazione eterogenea di vescicole batteriche Gram-negative della membrana esterna in base alle loro dimensioni

In condizioni di coltura adeguate, i batteri gram-negativi rilasciano vescicole della membrana esterna che trasportano il carico, o OMV, nel surnatante. Queste vescicole sono strutture sferiche di dimensioni eterogenee, piccole, che mediano la comunicazione cellulare.

Per frazionare sottopopolazioni di OMV di dimensioni diverse, prendere una colonna cromatografica vuota ad esclusione dimensionale con un filtro appropriato alla base per supportare la matrice.

Imballare la colonna con una matrice di filtrazione su gel costituita da perle sferiche chimicamente inerti di dimensioni dei pori definite, assicurando che la dimensione sia ottimale per escludere l'ingresso di OMV di grandi dimensioni. Equilibrare la colonna con un tampone appropriato per evitare che le perle si secchino per una purificazione ottimale.

Caricare il surnatante della coltura batterica contenente sottopopolazioni di OMV, aggregati proteici e acidi nucleici di diverse dimensioni sulla parte superiore della colonna. Lasciare che i campioni passino con la forza di gravità.

Mentre i campioni passano attraverso la colonna, gli OMV più grandi che non possono entrare nei pori, si muovono attraverso gli spazi interparticellari tra le perle di gel per essere eluiti per primi. Nel frattempo, gli OMV più piccoli penetrano nei pori della matrice, prendono un percorso più lungo ed eluiscono in seguito.

A causa delle loro dimensioni ridotte, gli aggregati proteici e gli acidi nucleici entrano in vari pori della matrice, causando il tempo di ritenzione più lungo nella colonna ed eluizione come le ultime frazioni. Raccogli eluati OMV separati e conservali per ulteriori analisi.

Per iniziare, utilizzare una bacchetta di vetro per mescolare un flacone di mezzo filtrante in gel e versare il volume necessario per riempire la colonna più circa il 50% di eccesso, in un flacone di vetro. Lasciare che le perline si depositino e decantare il liquido in eccesso. Risospendere le perle nel tampone di eluizione in una soluzione finale di circa il 70% di gel e il 30% di tampone e degassare la soluzione sotto vuoto.

Montare la colonna su un supporto ad anello in posizione verticale e riempire la colonna con un tampone di eluizione per bagnare le pareti, prima di svuotare il tampone fino a quando non rimane solo circa 1 centimetro. Quindi, pipettare con cura le perle di gel nella colonna, drenando contemporaneamente il tampone in eccesso per evitare che le perle si depositino, fino a quando la colonna non viene impacchettata a un'altezza di circa 2 centimetri sotto il fondo del serbatoio della colonna.

Prima di caricare il campione, degassare il tampone di eluizione sotto vuoto. Lavare la colonna con circa due volte il volume del tampone di eluizione. Una volta che il tampone raggiunge la parte superiore dello strato di gel, aggiungere con cura 2 millilitri di un campione di vescicola della membrana esterna da 100 a 200 nanomoli per litro sopra lo strato di gel senza disturbare la superficie e lasciare che il campione entri nel gel.

Lentamente, aggiungere il tampone di eluizione alla colonna senza disturbare lo strato di gel e posizionare una provetta da 50 millilitri sotto la colonna. Per evitare che la colonna si secchi, aggiungere contemporaneamente un tampone di eluizione alla parte superiore della colonna.

Dopo aver raccolto 20 millilitri di eluato, posizionare un rack di provette da 1,5 millilitri sotto la colonna. Raccogli un totale di 96 frazioni da 1 millilitro in ogni provetta. Durante la raccolta dei campioni, aggiungere continuamente il tampone di eluizione alla colonna. Per pulire la colonna, far passare 1 volume di idrossido di sodio molare 0,1 molare attraverso la colonna, seguito da 2 volumi di tampone di eluizione.