Cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento a fluorescenza: una tecnica per identificare l'integrità delle proteine di membrana fluorescenti dopo solubilizzazione con detergente

Le proteine batteriche integrali di membrana, ancorate alle membrane a doppio strato lipidico, facilitano il trasporto delle molecole attraverso le membrane e la trasduzione dei segnali. Per gli studi strutturali, specifiche proteine ricombinanti integrali di membrana sono sovraespresse con la proteina fluorescente verde fusa, GFP.

Per valutare la stabilità delle proteine di membrana ricombinanti dopo solubilizzazione con detergente, ottenere una frazione di membrana batterica contenente proteine di membrana integrali marcate con GFP. Aggiungere un detergente non ionico. Oltre la concentrazione critica, il detergente forma micelle.

Le micelle interagiscono con le membrane lipidiche e le proteine di membrana, solubilizzando le membrane e formando complessi proteina-detergente. Inoltre, le regioni transmembrana idrofobiche delle proteine di membrana possono rimanere non mascherate, causando l'aggregazione proteica. Inoltre, le GFP libere possono derivare dalla degradazione delle proteine di membrana.

Centrifugare il composto. Raccogliere il surnatante contenente la frazione solubilizzata nel detersivo.

Assemblare una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale collegata a un rivelatore a fluorescenza. La matrice della colonna comprende perle di agarosio con dimensioni dei pori che definiscono un ampio intervallo di frazionamento.

Equilibrare la colonna con un tampone contenente detergente per ridurre al minimo le interazioni aspecifiche e mantenere la solubilizzazione delle proteine.

Caricare la frazione di membrana solubilizzata nella colonna. Gli aggregati proteici eludono i pori più grandi e si muovono attraverso gli spazi interparticellari tra le perle, eluendo per primi. I complessi proteina-detergente più piccoli entrano in alcuni pori delle perle, attraversando un percorso più lungo, ed eluiscono in seguito. Le GFP libere entrano in tutti i pori del perlato ed eluiscono per ultime. Il rivelatore di fluorescenza analizza le frazioni eluite, rilevando la fluorescenza emessa da GFP.

I picchi di fluorescenza simmetrici dei complessi proteina-detergente con aggregati minimi e GFP libera indicano l'idoneità del detergente alla solubilizzazione delle proteine di membrana.

Per la cromatografia ad esclusione dimensionale rilevata in fluorescenza o per l'analisi FSEC, quindi, equilibrare una colonna ad esclusione dimensionale con un ampio intervallo di frazionamento con tampone di flusso in esecuzione a una velocità di 0,3 millilitri al minuto. Quindi, iniettare 100 microlitri di un campione di membrana solubilizzata sulla colonna alla stessa velocità di flusso e monitorare il profilo di illusione utilizzando l'ottica a fluorescenza.