Gascromatografia dello spazio di testa: una tecnica per valutare la concentrazione di etanolo negli embrioni di zebrafish

Per analizzare la concentrazione di etanolo, un composto organico volatile, iniziare prendendo il surnatante di coltura embrionale di zebrafish omogeneizzato trattato con etanolo in una fiala cromatografica. Il surnatante contiene altri composti organici non volatili oltre all'etanolo. Posizionare la fiala sigillata in un'unità campionatore del gruppo cromatografico e riscaldarla a una temperatura appropriata.

Durante il riscaldamento, l'etanolo vaporizza e migra nella fase gassosa o nello spazio di testa, lasciando dietro di sé i residui non volatili. Ciò consente al campionatore di introdurre etanolo gassoso in un flusso continuo di gas di trasporto. Questo agisce come una fase mobile.

L'etanolo passa attraverso la colonna cromatografica a spirale preriscaldata, che contiene un letto impaccato della fase stazionaria liquida. A causa della loro volatilità e polarità, le molecole di etanolo in movimento iniziano ad adsorbire le particelle della fase stazionaria, suddividendosi nella fase stazionaria.

A causa dell'elevata temperatura della colonna, l'adsorbimento delle molecole di etanolo è instabile e temporaneo, consentendo a queste molecole di desorbirsi gradualmente e migrare lungo il flusso del gas di trasporto. Queste molecole di etanolo subiscono una serie di eventi di adsorbimento-desorbimento per tutta la lunghezza della colonna.

Successivamente, l'etanolo entra in una camera di rilevamento che aiuta a determinare la sua concentrazione nel campione corrispondente all'area sotto la curva nel cromatogramma risultante.

Utilizzare due micropipette p200 impostate su 50 microlitri e aspirare la soluzione del cocktail di proteasi in una e l'acqua nella seconda. Quindi, posizionare rapidamente 10 embrioni in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando una pipetta di vetro e chiudere il tappo. Ripetere questo processo per tutti i campioni da testare, i controlli e gli embrioni trattati con etanolo.

Lavorando con un campione alla volta, aprire rapidamente il tappo e aspirare tutto il terreno embrionale residuo con una micropipetta p200 impostata su 200 microlitri. Rapidamente, ma delicatamente, aggiungere e rimuovere i 50 microlitri di acqua, quindi aggiungere i 50 microlitri di cocktail di proteasi e chiudere il tappo del tubo.

Lasciare riposare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere rapidamente 450 microlitri di cloruro di sodio 5 molare e chiudere il tappo della provetta. Omogeneizzare il campione mediante vortice per 10 minuti e trasferire 2 microlitri di surnatante in una fiala per gascromatografia. Sigillare il flaconcino con un tappo in politetrafluoroetilene.

Dopo aver completato il metodo di avvio, caricare 436 Current spme ethanol 2013 3 minuti assorbire 2_5min rg run. METH dal menu Metodi nel software di analisi per ogni campione nell'elenco dei campioni. Compila l'elenco dei campioni, iniziando con gli spazi vuoti del cocktail di aria, acqua e 5 cocktail di proteasi di cloruro di sodio molare. Quindi, inserire gli standard di etanolo nell'ordine da 0,3125 a 40 millimolari.

Segui gli standard con il secondo giro di spazi vuoti. Inserisci tutti i campioni di surnatante embrionale omogeneizzato da testare, dalla concentrazione di etanolo più bassa a quella più alta prevista, e termina inserendo un terzo giro di spazi vuoti.

Aggiungere le fiale per gascromatografia all'autocampionatore nell'ordine in cui sono stati inseriti i campioni e lasciarle riscaldare per 10-15 minuti. Quindi, avviare le esecuzioni di esempio utilizzando il software. Al termine di tutte le esecuzioni, attivare il metodo di arresto aggiungendo un campione finale nell'elenco dei campioni ed eseguendo lo standby. METANFETAMINA. Eseguire il backup di tutti i dati acquisiti durante l'esecuzione del campione.

Una volta completato il metodo di spegnimento, fare clic su Apri cromatogramma e aprire la cartella con i risultati. I campioni vengono integrati automaticamente in questo programma. Nei risultati, assicurati che siano stati integrati i picchi corretti. Una volta confermati tutti i campioni, stampare o esportare i risultati.

Traccia l'altezza di picco degli standard di etanolo su un grafico. Quindi, calcola i valori di pendenza, intercetta Y e R al quadrato. Ottenere il valore dell'etanolo per ciascun campione sottraendo l'altezza del picco del campione dall'intercetta Y degli standard e dividendo questo valore per la pendenza degli standard.

Per calcolare la concentrazione di etanolo negli embrioni, calcolare il fattore di diluizione per ciascun campione e moltiplicare il valore dell'etanolo del campione per questo fattore di diluizione. Infine, calcolare i campioni di riferimento dei terreni moltiplicando il valore dell'etanolo per un fattore di diluizione pari a 10.