Elettroforesi su gel di poliacrilammide: una tecnica analitica per rilevare solfati di eparan di varie lunghezze di catena isolati dal tessuto polmonare di topo

I glicosaminoglicani solfatati come gli eparan solfati, HS, sono polisaccaridi solfatati lineari caricati negativamente di lunghezza variabile a catena, attaccati alle proteine della superficie cellulare.

Per stimare le HS di diversa lunghezza isolate dal tessuto polmonare di topo, iniziare con l'assemblaggio della cassetta di gel. Riempirlo parzialmente con una soluzione di acrilammide-bisacrilammide altamente concentrata, compresi gli agenti catalizzanti: persolfato di ammonio e tetra-metil-etilene-diammina. Ricoprire con acqua per evitare il contatto con l'aria, che può inibire la polimerizzazione. Incubare.

Gli agenti catalizzanti inducono la polimerizzazione dell'acrilammide-bisacrilammide, formando gel risolutivo a pori piccoli. Scartare l'acqua. Aggiungere una soluzione a bassa concentrazione di acrilammide-bisacrilammide con agenti catalizzanti. Inserire un pettine in gel per creare dei pozzetti. La soluzione polimerizza, formando un gel di impilamento a pori larghi.

Caricare le camere del serbatoio di elettroforesi con un tampone di funzionamento per una conduttività elettrica ottimale durante l'elettroforesi.

Sciogliere la miscela HS nel tampone di caricamento contenente colorante tracciante e saccarosio. Quindi, trasferisci questa miscela e le scale HS standard nei pozzetti a cassetta. Il saccarosio confina la miscela nei pozzetti. Il colorante aiuta a monitorare la progressione dell'elettroforesi.

Avviare l'elettroforesi a bassa tensione. Gli HS caricati negativamente attraversano il gel di impilamento, spostandosi verso l'anodo caricato positivamente, e si concentrano all'interfaccia del gel di risoluzione dello stacking a causa della differenza di dimensione dei pori.

Aumentare la tensione. Gli HS a catena piccola migrano rapidamente attraverso il gel risolutivo, attraversando più lontano, mentre gli HS a catena lunga rimangono intrappolati all'interno della matrice del gel e si muovono lentamente.

Dopo l'elettroforesi, colorare il gel. Gli HS appaiono come bande distinte, con gli HS a catena piccola posizionati più in basso rispetto agli HS a catena lunga. La lunghezza dei singoli HS può essere determinata confrontandoli con gli standard HS.

Iniziare inserendo una cassetta vuota nel serbatoio PAGE. Gettare il gel risolutivo mescolando 10 millilitri di soluzione di gel risolutivo con 60 microlitri di persolfato di ammonio al 10% appena preparato in una provetta da 15 millilitri. Quindi, aggiungere 10 microlitri di TEMED. Capovolgere delicatamente il tubo 2 o 3 volte.

Aggiungere rapidamente 10 millilitri della soluzione di gel di poliacrilammide attivato alla cassetta utilizzando una pipetta. Sovrapporre con 2 millilitri di acqua filtrata deionizzata e lasciare polimerizzare il gel risolutivo per 30 minuti.

Dopo che il gel risolutivo si è completamente polimerizzato, scartare l'acqua sovrapposta. Gettare il gel di impilamento mescolando 3 millilitri di soluzione di gel di impilamento con 90 microlitri di persolfato di ammonio al 10% appena preparato in una provetta da 15 millilitri. Quindi, aggiungere 3 microlitri di TEMED e capovolgere delicatamente il tubo 2 o 3 volte.

Utilizzare una pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di gel da impilare sul gel risolutivo solidificato, fino a riempire la cassetta fino all'orlo. Inserire completamente il pettine incluso con la cassetta vuota del gel di poliacrilammide e lasciare che il gel di impilamento polimerizzi per 30 minuti. Una volta che il gel si è polimerizzato, rimuovere la striscia di nastro adesivo dalla parte inferiore della cassetta e riposizionare la cassetta nel gruppo del serbatoio PAGE. Riempire le camere superiore e inferiore con le rispettive soluzioni tampone.

Sciogliere i campioni di glicosaminoglicani essiccati nel volume minimo necessario di acqua deionizzata e filtrata e miscelare con il tampone di caricamento del campione in un rapporto 1 a 1. Caricare i campioni e le scale degli oligosaccaridi HS nel gel.

Ripetere il gel per 5 minuti a 100 volt. Quindi, farlo funzionare a 200 volt per 20-100 minuti, a seconda della percentuale di acrilammide della soluzione di gel risolutiva.