Elettroforesi su gel di poliacrilammide urea denaturante per l'analisi dell'RNA: una tecnica per separare gli oligonucleotidi di RNA fosforilati marcati in fluorescenza dai loro equivalenti non fosforilati

Per iniziare, prelevare un campione contenente oligonucleotidi di RNA fosforilati e non fosforilati marcati in fluorescenza mescolati con il colorante di caricamento contenente urea. Riscaldare il campione.

L'urea - un forte denaturante - in combinazione con il calore denatura la struttura secondaria dell'RNA, determinando la sua conformazione linearizzata e non strutturata. Ora, cosciare il gel mescolando la soluzione di acrilammide-bisacrilammide con l'urea.

Aggiungere tetrametilene diammina, un catalizzatore, e persolfato di ammonio, un agente ossidante, per facilitare la successiva polimerizzazione del gel.

Versare la soluzione in un apparecchio a cassetta preassemblato. Inserire un pettine, creando pozzetti per il caricamento del campione. Lasciare polimerizzare il gel. Posizionare la cassetta nell'apparecchio per gel. Aggiungi un buffer di corsa ai serbatoi superiore e inferiore, mantenendo il flusso di corrente attraverso l'intero gel. Rimuovere il pettine.

Caricare il campione miscelato con il colorante di visualizzazione nel pozzetto e collegare il gel a un alimentatore alla tensione desiderata. L'urea nel gel consente alle molecole di RNA di migrare come specie lineari.

Il gel agisce come un setaccio, consentendo alle molecole di RNA caricate negativamente di muoversi attraverso i pori verso l'elettrodo positivo. Durante la corsa, l'RNA fosforilato essendo intrinsecamente più negativo si muove più velocemente dell'RNA non fosforilato.

Immagine del gel per la rilevazione di RNA marcato in fluorescenza. Osservare lo spostamento di mobilità tra l'RNA fosforilato a migrazione più rapida, che appare come una banda più bassa rispetto all'RNA non fosforilato.

Per preparare una soluzione di gel di acrilammide denaturante al 15%, combinare 22,5 millilitri di soluzione premiscelata di acrilammide 29:1 al 40%, 6 millilitri di TBE 10X, 28,8 grammi di urea e acqua priva di RNasi per un volume totale di 59 millilitri. Quindi, mescola delicatamente la soluzione.

Scaldare la soluzione nel microonde per 20 secondi, mescolarla e rimetterla immediatamente nel microonde per altri 20 secondi. Mescolare delicatamente la soluzione fino a quando l'urea non è completamente sciolta. Immergere il bicchiere di vetro in un bagno di acqua poco profonda, contenente acqua fredda, per 5 minuti, assicurandosi che il livello di acqua fredda che circonda il bicchiere di vetro sia superiore al livello della soluzione all'interno del bicchiere di vetro. Quando la soluzione è fredda, filtrarla e degassarla con un'unità di filtrazione monouso da 0,22 micrometri per rimuovere il particolato e le bolle d'aria microscopiche.

Lavare un piatto di vetro corto e lungo con acqua e sapone. Quindi, spruzza ogni piastra con etanolo al 95% e pulisci il vetro per rimuovere l'umidità. Sollevare la piastra lunga dal piano di lavoro posizionandola sopra una scatola. Quindi, posizionare i distanziatori da 0,4 millimetri lungo i bordi lunghi della piastra. Appoggiare la piastra corta sopra la piastra lunga, assicurandosi che i bordi della piastra corta, della piastra lunga e dei distanziatori siano allineati. Quindi, clamp ciascun lato con tre morsetti metallici equidistanti.

Aggiungere 24 microlitri di TEMED alla soluzione di acrilammide e mescolare. Quindi, aggiungere 600 microlitri di APS al 10% e versare immediatamente la soluzione tra le lastre di vetro.

Versare la soluzione di acrilammide tra il sandwich di lastra di vetro può essere davvero impegnativo. Per evitare bolle d'aria, picchietta il panino con lastra di vetro mentre versi la soluzione.

Con attenzione, aggiungi un pettine pulito a 32 pozzetti sulla parte superiore del sandwich di lastre di vetro e lascia che l'acrilammide polimerizzi per 30 minuti.

Per far funzionare il gel, impostare il blocco termico a 75 gradi Celsius, rimuovere i morsetti metallici e lavare e asciugare accuratamente il panino con lastra di vetro. Posizionare il sandwich di piastre nell'apparato in gel con la piastra corta rivolta in avanti e preparare un tampone di corsa 0,5X TBE combinando 100 millilitri di 10X TBE con 1,9 litri di acqua priva di RNasi.

Aggiungere 600 millilitri di tampone di corsa alle camere superiore e inferiore dell'apparato. Rimuovere delicatamente il pettine dal gel e sciacquare accuratamente i pozzetti con una siringa. Pre-eseguire il gel a 50 watt per 30 minuti. Quindi, sciacquare nuovamente i pozzetti.

Pulse spin le reazioni estinte e incubarle a 75 gradi Celsius per 3 minuti. Ripetere la centrifuga a impulsi e caricare immediatamente 10 microlitri di ciascun campione sul gel. Quindi, fai funzionare il gel per 3 ore a 50 watt. Al termine della corsa, spegnere l'alimentazione e svuotare la camera superiore dell'apparecchio.

Lavare e asciugare il lato esterno del panino con lastra di vetro. Quindi, coprilo con un foglio e trasferiscilo su uno scanner laser per l'imaging. Montare il sandwich di lastra di vetro sul tavolino dello scanner laser, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per il fluoroforo desiderato e visualizzare il gel.