Elettroforesi su gel di poliacrilammide urea denaturante per l'analisi dell'RNA: una tecnica per separare gli oligonucleotidi di RNA fosforilati marcati in fluorescenza dai loro equivalenti non fosforilati

Per iniziare, prelevare un campione contenente oligonucleotidi di RNA fosforilati e non fosforilati marcati in fluorescenza mescolati con il colorante di caricamento contenente urea. Riscaldare il campione.

L'urea - un forte denaturante - in combinazione con il calore denatura la struttura secondaria dell'RNA, determinando la sua conformazione linearizzata e non strutturata. Ora, cosciare il gel mescolando la soluzione di acrilammide-bisacrilammide con l'urea.

Aggiungere tetrametilene diammina, un catalizzatore, e persolfato di ammonio, un agente ossidante, per facilitare la successiva polimerizzazione del gel.

Versare la soluzione in un apparecchio a cassetta preassemblato. Inserire un pettine, creando pozzetti per il caricamento del campione. Lasciare polimerizzare il gel. Posizionare la cassetta nell'apparecchio per gel. Aggiungi un buffer di corsa ai serbatoi superiore e inferiore, mantenendo il flusso di corrente attraverso l'intero gel. Rimuovere il pettine.

Caricare il campione miscelato con il colorante di visualizzazione nel pozzetto e collegare il gel a un alimentatore alla tensione desiderata. L'urea nel gel consente alle molecole di RNA di migrare come specie lineari.

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