Elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu: una tecnica di separazione non denaturante per l'analisi di complessi di catene respiratorie mitocondriali intatti

Per analizzare i cinque complessi mitocondriali della catena respiratoria con subunità intatte, ottenere complessi mitocondriali solubilizzati in un detergente delicato e non ionico. Miscelare con tampone contenente Coomassie Blue-G, un colorante anionico.

Coomassie sostituisce il detersivo e si lega in modo non specifico ai complessi, conferendo carica negativa e macchiandoli di blu. Inoltre, Coomassie impedisce ai complessi di aggregarsi e aiuta a preservare la loro struttura e funzione native.

In una vasca per elettroforesi, assemblare una cassetta di gel comprendente gel a risoluzione sfumata con dimensione dei pori decrescente lungo la lunghezza, sovrapposta a gel impilabile di grandi dimensioni. Riempire le camere anodiche e catodiche con anodo raffreddato e tampone catodico contenente Coomassie.

Caricare i pozzetti con la miscela di complesso proteico legato a Coomassie. Iniziare l'elettroforesi.

I complessi proteici caricati negativamente migrano dal gel di impilamento al gel a risoluzione del gradiente, verso l'anodo caricato positivamente. Mentre i complessi più piccoli attraversano rapidamente i pori, i complessi più grandi sono rallentati da dimensioni restrittive dei p