Multimer-PAGE per la separazione di complessi proteici nativi: una tecnica di separazione ibrida costituita da Blue Native-PAGE e SDS-PAGE per separare le proteine multimeriche intatte dal lisato tissutale

I complessi proteici multimerici sono essenziali per vari processi biologici.

Per separare i complessi proteici nel loro stato nativo mediante multimer-PAGE, prendere il lisato tissutale contenente i complessi desiderati. Caricare il lisato su un gruppo di gel per Blue native PAGE.

Riempire il sistema con un tampone alcalino contenente colorante anionico blu e collegarlo all'alimentazione. A pH alcalino, le molecole di colorante si legano al complesso proteico conferendogli una carica negativa complessiva senza denaturazione. Questo complesso proteico intatto e caricato negativamente migra attraverso il gel come una banda blu.

Dopo una corsa minima e consentendo alla proteina intatta di migrare nel gel risolutivo, asportare la striscia contenente il complesso. Incubare la striscia in una soluzione contenente un agente reticolante per consentire ai suoi gruppi reattivi di interagire con i gruppi amminici della proteina prossimale, stabilizzando il complesso multimerico.

Sostituire la soluzione reticolante con un reagente di tempra per attenuare l'attività dei reticolanti non reagiti. Aggiungi SDS - un detergente anionico - che conferisce una carica negativa uniforme al complesso proteico intatto preservandone le dimensioni e la composizione native.

Posizionare la striscia trattata in una nuova cassetta e rifonderla in un nuovo gel SDS-PAGE. Durante l'elettroforesi, il complesso proteico reticolato caricato negativamente migra verso l'anodo positivo e appare come una banda ad alto peso molecolare nel gel.

Per iniziare questa procedura, prepararsi per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu, come descritto nel protocollo di testo. Collegare gli elettrodi all'alimentatore ed elettroforare le proteine nel gel a 150 volt, fino a quando la banda del colorante progredisce di circa 2 centimetri nello strato di risoluzione. A questo punto, fermate e scollegate l'alimentazione.

Dopo aver smontato l'apparecchio per elettroforesi, separare le lastre di vetro della cassetta per gel. Rimuovere ed eliminare lo strato di impilamento.

Tagliare con cura il gel, appena sotto il bordo inferiore del fronte della tintura, avendo cura di rendere questo taglio il più liscio e dritto possibile. Quindi, scartare il pezzo di gel inutilizzato. Taglia via le parti inutilizzate lungo i bordi della striscia di gel.

Posizionare con cura la striscia in 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato in un piccolo contenitore e mescolare delicatamente per nutazione per 30 minuti per equilibrare. Dopo l'equilibratura, scartare e sostituire il PBS con altri 10 millilitri.

Pipettare 500 microlitri di DSP da 25 millimolari disciolti in dimetilsolfossido nel PBS e continuare a mescolare come prima, per 30 minuti. Dopo 30 minuti, versare la soluzione DSP. Aggiungere 10 millilitri di Tris-HCl molare da 0,375, pH 8,8, contenente il 2% di dodecil solfato di sodio, per spegnere il DSP non reagito. Continuare la nutazione per 15 minuti.

Mentre la striscia di gel è in fase di tempra, preparare le soluzioni di gel SDS-PAGE secondo i metodi standard. Non aggiungere i reagenti di polimerizzazione. Dopo la tempra, riportare la striscia di gel nativo blu a temperatura ambiente e gettare la striscia in una nuova cassetta di gel.

Per fare ciò, raccogli con cura il gel e posizionalo su una piastra distanziatrice per cassetta gel pulita. Orientare la striscia in modo che sia capovolta rispetto all'orientamento precedente e che la parte inferiore della parte anteriore del colorante sia più vicina alla parte superiore della nuova cassetta.

Posizionare la striscia in modo che il suo bordo superiore si trovi allo stesso livello del punto in cui si troverà il bordo superiore della piastra di copertura. Assicurati che la parte anteriore del colorante sia parallela ai bordi orizzontali della lastra di vetro. Spingere un lato della striscia asportata contro una delle pareti del distanziatore, lasciando spazio sull'altro lato per versare il gel e caricare uno standard proteico o una scala. Se il bordo inferiore della striscia di gel contiene aree frastagliate o irregolari, tagliarle via con cura.

Una volta posizionata correttamente la striscia di gel, appoggiare la piastra di copertura sopra la piastra distanziatrice. Applicare una leggera pressione per espellere eventuali bolle d'aria intrappolate. Continuare a montare l'apparecchio per versare il gel, secondo le istruzioni del produttore.

La striscia di gel a volte si sposta quando viene posizionata la piastra superiore. Aiuta a far pendere un po' la striscia dal bordo della piastra superiore, in modo che possa essere regolata con una spatola per correggere eventuali spostamenti.

Aggiungere i reagenti di polimerizzazione al tampone gel risolutivo e versarlo nella cassetta del gel preparata utilizzando una pipetta sierologica. Riempire la cassetta del gel fino a circa 2 centimetri sotto la striscia di gel nativo blu PAGE asportata per lasciare spazio allo strato di impilamento. Quindi, aggiungere 100 microlitri di butanolo sopra il gel colato e attendere 30 minuti per la polimerizzazione dello strato risolutivo prima di versare il butanolo.

Quindi, aggiungere i reagenti di polimerizzazione alla soluzione di gel di impilamento. Utilizzando una pipetta sierologica, versare lo strato di impilamento per riempire tutti gli spazi vuoti rimanenti nella cassetta del gel. Inclinare la cassetta del gel mentre lo strato di impilamento viene versato, in modo che riempia lo spazio sotto la striscia di gel e le bolle d'aria non rimangano intrappolate.

Man mano che il tampone di gel impilabile riempie lo spazio vuoto sotto la striscia di gel, riportare gradualmente la cassetta del gel in piano. Continua a riempire lo spazio vuoto accanto alla striscia di gel asportata con il tampone di gel di impilamento, fino a quando non trabocca quasi. Quindi, lasciare polimerizzare lo strato di impilamento per 30 minuti.

Dopo che lo strato di impilamento si è polimerizzato, rimuovere la cassetta del gel dall'apparecchio di colata, sciacquarla con acqua distillata e assemblare l'apparecchio per elettroforesi, secondo le istruzioni del produttore.

Riempire completamente la camera interna con 1X SDS-PAGE running buffer. Quindi, riempire la camera esterna fino al livello indicato dal produttore. Caricare lo spazio accanto alla striscia di gel asportata con una scala di peso molecolare o lo standard proteico appropriato.

Collegare gli elettrodi all'alimentatore ed elettroforare i campioni a 120 volt. Quando il colorante Coomassie fuoriesce dal gel, interrompere la corsa e scollegare l'alimentazione. Analizza il gel utilizzando metodi standard di elettroblotting e rilevamento delle proteine basato su anticorpi.