Elettroforesi su gel di agarosio di ampliconi di DNA post PCR: un metodo per analizzare i prodotti della PCR multiplex e valutare il successo della reazione PCR

Per analizzare gli ampliconi di DNA - frammenti di DNA amplificati di lunghezza specifica - risultanti dalla reazione a catena della polimerasi multiplex, PCR, utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio, assemblare un vassoio di colata con un pettine per creare pozzetti per il caricamento del campione.

Versare un'appropriata concentrazione di agarosio fuso, un polisaccaride lineare, disciolto in tampone per elettroforesi, integrato con un colorante fluorescente al DNA, sul vassoio di colata e lasciare solidificare.

L'agarosio fuso polimerizza, formando un gel tridimensionale con pori microscopici.

Posizionare il gel colato in una vasca per elettroforesi, con il lato del pettine orientato vicino al catodo negativo. Il serbatoio contiene il tampone per elettroforesi utilizzato nella preparazione del gel per mantenere una conduttività ottimale. Rimuovere il pettine.

Trasferire il campione di prodotto PCR, miscelato con una soluzione di colorante di carico per monitorare la migrazione del campione, nei pozzetti. Caricare un pozzetto con scale di DNA di lunghezza definita. Iniziare l'elettroforesi.

Gli ampliconi del DNA, con gruppi fosfato negativi equidistanti, migrano dai pozzetti nel gel verso l'anodo positivo e si separano in base alla loro lunghezza a causa dell'elevata mobilità degli ampliconi più corti rispetto a quelli più grandi. Contemporaneamente, il colorante fluorescente positivo del DNA nel gel migra nella direzione opposta e si combina con gli ampliconi del DNA, intercalandosi tra le basi.

Dopo l'elettroforesi, visualizzare il gel utilizzando la luce ultravioletta. Per una PCR di successo, gli ampliconi di DNA intercalati con colorante appaiono come bande discrete e fluorescenti più vicine alla scala della lunghezza prevista dell'amplicona. La resa dell'amplicone può essere stimata attraverso l'intensità della fluorescenza.

Secondo le raccomandazioni del produttore, aggiungere la polvere di gel di agarosio in 1x tampone TBE per raggiungere l'1,5 percento (peso/volume) e riscaldare per sciogliersi.

Prima del lancio, inclinare brevemente la soluzione di gel disciolto sotto l'acqua corrente. Aggiungere 5 microlitri di colorante fluorescente per acidi nucleici per 50 microlitri di soluzione in gel e mescolare.

Assemblare e livellare il vassoio di colata. Aggiungere i pettini in base al numero di campioni. Versare la soluzione di gel nel calco e attendere che si solidifichi.

Successivamente, immergere il calco contenente il gel in 1x tampone TBE in un sistema di elettroforesi su gel. Mescolare 5 microlitri di prodotti PCR insieme a 2 microlitri di colorante di caricamento in nuove strisce PCR. Trasferire 5 microlitri di miscele nei pozzetti del gel. Salvate almeno un pozzo vuoto. Aggiungere 5 microlitri di scala del DNA nel pozzetto vuoto come riferimento.

Collegare gli elettrodi e far funzionare il gel a 110 volt per 15 centimetri per circa 1 ora. Utilizzare un sistema di imaging su gel basato su UV per verificare la presenza di più bande che rappresentano gli ampliconi della PCR.