Elettroforesi capillare: una tecnica per analizzare gli ampliconi di reazione a catena della polimerasi marcati in fluorescenza

Per determinare le dimensioni dei frammenti di DNA utilizzando l'elettroforesi capillare, iniziare prelevando una piastra di saggio a più pozzetti. Ogni pozzetto contiene ampliconi PCR marcati in fluorescenza e di dimensioni diverse, oligonucleotidi di DNA a doppio filamento ottenuti dopo un ciclo di PCR.

Aggiungi alcuni frammenti di DNA a doppio filamento di dimensioni diverse al pozzetto, che fungono da standard di dimensione. Ognuna di queste molecole di DNA è dotata di un'etichetta fluorescente per una facile identificazione.

Integrare il pozzo con formammide, un forte denaturante, e scaldare ad alta temperatura. Questo passaggio denatura il DNA, formando frammenti a filamento singolo che possono migrare facilmente attraverso i pori del gel.

Posizionare la piastra in un'unità analizzatore di frammenti che contiene gel polimerico pre-iniettato all'interno del suo sistema capillare.

Applicare un'alta tensione per introdurre elettrocineticamente il DNA dal pozzetto nel capillare di diametro sottile al catodo, il terminale negativo. Le molecole di DNA caricate negativamente migrano verso l'anodo caricato positivamente. I filamenti di DNA più corti affrontano meno forza di attrito e si muovono più velocemente attraverso il gel rispetto ai filamenti di DNA più lunghi.

Durante l'elettromigrazione, il DNA attraversa il percorso del raggio laser, provocando la fluorescenza del colorante. I segnali di emissione del colorante vengono catturati da un rivelatore e successivamente tradotti in un elettroferogramma, un grafico che rappresenta ogni DNA fluorescente come un picco individuale di colore diverso.

Confronta il picco del frammento di DNA sconosciuto con i picchi di riferimento per analizzarne le dimensioni.

Dopo la conferma degli ampliconi per PCR, utilizzare nuove strisce o piastre per PCR per diluire i prodotti PCR da 1 a 10 in acqua purificata. Vortice e centrifugare brevemente. Mentre si lavora in una cappa aspirante, preparare una miscela master in una provetta da centrifuga composta da formammide e soluzione standard di dimensione di riferimento.

In base al numero di prodotti PCR da analizzare, utilizzare i volumi dei reagenti, come dettagliato nel manoscritto. Consentire un volume in eccesso del 10%.

Agitare brevemente e distribuire 9,5 microlitri in pozzetti individuali su una piastra PCR, appropriata per il sistema di elettroforesi capillare disponibile. Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di prodotto PCR diluito. Sigillare e centrifugare brevemente.

Quindi, caricare la piastra contenente i campioni in un termociclatore PCR e denaturare i campioni a 95 gradi Celsius per 3 minuti, prima di raffreddarli a 4 gradi Celsius all'infinito. Centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto. Rimuovere con cautela il sigillo e caricare la piastra su un sistema di elettroforesi capillare calibrato secondo le istruzioni del produttore.

Eseguire l'elettroforesi capillare dell'analisi dei frammenti utilizzando i reagenti appropriati per l'apparecchiatura scelta e regolare le condizioni di esecuzione in base alla descrizione nel manoscritto.