Elettroforesi capillare microfluidica per il dimensionamento dei frammenti dei prodotti PCR: una tecnica di separazione elettroforetica basata su microchip per separare i frammenti di DNA in base alle dimensioni

L'elettroforesi microfluidica è una tecnica per separare frammenti di DNA di diverse dimensioni all'interno di microcapillari.

Per iniziare, prendi un chip microfluidico a più pozzetti con pozzetti designati per la miscela di polimero a base di gel e colorante fluorescente, campioni di DNA e una scala di DNA a peso molecolare nota. Questi pozzi sono interconnessi tra loro tramite una rete di microcanali.

Erogare la miscela gel-colorante nei pozzetti assegnati. Assemblare il chip su una stazione di adescamento predotata di una siringa vuota. Premere lo stantuffo della siringa, esercitando una pressione per forzare la miscela gel-colorante nel microcanale di separazione.

Rimuovere il chip e pipettare gli altri componenti nei rispettivi pozzetti. Aggiungere un marcatore - uno standard interno che calibra il dimensionamento del campione - ai pozzetti contenenti la scala e i campioni.

Inserire il microchip in un analizzatore di frammenti per far funzionare il chip. Una volta all'interno, la tensione applicata genera forze elettroforetiche, spingendo il campione dal pozzetto nel microcanale di caricamento del campione da dove raggiunge l'intersezione trasversale tra questo canale e il canale di separazione. La corrente elettrica aiuta il campione a entrare nel microcanale di separazione.

Le molecole di colorante fluorescente intercalano frammenti di DNA caricati negativamente che si muovono verso l'anodo a diverse velocità elettroforetiche rispetto alla loro dimensione molecolare - frammenti più piccoli migrano più velocemente di quelli più grandi. Di conseguenza, i frammenti si separano in bande di dimensioni diverse che emettono fluorescenza.

Un rivelatore laser misura la fluorescenza di ciascuna banda e la registra come un elettroferogramma che visualizza il DNA di dimensioni diverse come un picco distinto.

Prima di iniziare, portare il concentrato di colorante del DNA, la matrice del gel di DNA, il marcatore del DNA, la scala del DNA e i campioni di DNA purificato a temperatura ambiente. Impostare la stazione di adescamento sostituendo la siringa e regolando la piastra di base. Quindi, rilasciare la leva della clip della siringa e farla scorrere nella posizione più alta.

Avvia il software di dimensionamento e prepara la miscela gel-colorante. Agitare il concentrato di colorante per 10 secondi e farlo girare verso il basso. Quindi, aggiungere 25 microlitri di colorante a una fiala di matrice di gel e mescolare la soluzione.

Trasferire la miscela di colorante gel in un filtro rotante. Mettetelo nella centrifuga e fatelo girare per 10 minuti a 1.500 volte g. Quando sei pronto per caricare la miscela gel-colorante, inserisci un nuovo chip di DNA nella stazione di adescamento e aggiungi 9 microlitri della miscela gel-colorante nel pozzetto contrassegnato con "G".

Chiudere la stazione di adescamento e assicurarsi che lo stantuffo sia posizionato in corrispondenza del segno di 1 millilitro. Premere lo stantuffo della siringa verso il basso, finché non viene trattenuto dalla clip. Attendere esattamente 30 secondi, quindi rilasciare la clip. Attendere altri 5 secondi, quindi tirare lentamente lo stantuffo in posizione di 1 millilitro.

Aprire la stazione di adescamento e aggiungere 9 microlitri di miscela di colorante gel nei pozzetti contrassegnati con "G". Aggiungere 5 microlitri di pennarello nel pozzetto contrassegnato con il simbolo di una scala e ciascuno dei 12 pozzetti del campione.

Aggiungere 1 microlitro della scala al pozzetto con il simbolo della scala e 1 microlitro del prodotto PCR o dell'acqua ai pozzetti del campione. Agitare il chip per 1 minuto a 2.400 giri/min. Inseriscilo nel bioanalizzatore ed esegui il chip entro cinque minuti.