Focalizzazione isoelettrica in fase liquida: una tecnica di elettroforesi per separare le molecole bioattive dall'estratto grezzo di Gymnema sylvestre

Iniziate con una cella IEF a focalizzazione isoelettrica preassemblata, un'unità di elettroforesi in fase liquida. Questa colonna è una camera porosa orizzontale compartimentata con terminali positivi e negativi distinti alle estremità.

Ora, prendete l'estratto vegetale contenente una miscela complessa di componenti di carica diversa con punti isoelettrici variabili, pI - un pH in cui la carica netta su una molecola è zero.

L'estratto è integrato con anfoliti di carica variabile che facilitano il successivo frazionamento dei componenti del campione.

Caricare il campione nelle porte di caricamento della colonna. Attualmente, la colonna IEF ha un pH costante. Quindi, applicare l'alta tensione per avviare l'elettroforesi.

Sotto il campo elettrico, gli anfoliti solubili migrano verso elettrodi di carica opposta e stabiliscono un gradiente di pH lineare attraverso la colonna. I componenti del campione iniziano a migrare attraverso il gradiente di pH in fase liquida e quelli posizionati a pH inferiore al loro pI hanno una carica positiva netta.

Questi migrano verso l'elettrodo negativo fino a quando i componenti raggiungono il loro pI, dove la loro carica si neutralizza e la migrazione si ferma. Allo stesso modo, i componenti a pH superiore al loro pI migrano verso l'elettrodo positivo e si fermano quando raggiungono il loro pI. In questo modo i componenti del campione vengono separati in compartimenti focalizzati in base al loro pI. Raccogliere le frazioni purificate per ulteriori analisi.

Aggiungere 0,6 grammi di estratto vegetale di Gymnema sylvestre a 60 millilitri di acqua distillata. Sciogliere l'estratto vegetale mescolando in un tubo a rullo per cinque minuti.

Per rimuovere le particelle insolubili, centrifugare la soluzione a 10.000 x g per cinque minuti. Trasferire il surnatante in un becher di vetro da 150 millilitri e aggiungere anfolita per creare una soluzione all'1% in volume, circa 0,6 millilitri.

Utilizzando una siringa da 50 millilitri, con un ago smussato da 1,5 pollici calibro 19, caricare la soluzione nella cellula IEF attraverso le porte di raccolta del campione. Quindi, rimuovere la cella dal supporto e picchiettare la camera dell'elettrodo per rimuovere e rimuovere eventuali bolle.

Collegare l'unità all'acqua di raffreddamento. Con la potenza fornita a 15 watt costanti, iniziare il frazionamento. Far funzionare l'unità IEF fino a quando la tensione raggiunge un valore costante, circa tre ore.

Dopo aver premuto il pulsante Harvest ON, allineare i perni del raccoglitore di frazioni con le porte di raccolta. Spingere i perni attraverso il nastro sigillante per iniziare a raccogliere le frazioni di Gymnema sylvestre.