Elettroforesi capillare con affinità di spostamento di mobilità: un metodo per analizzare le interazioni campione-ligando in base alla migrazione differenziale dei complessi proteina-ligando

I ligandi, come gli ioni metallici, si legano in modo non covalente a una proteina specifica, formando un complesso di ioni proteina-metallo. Questo legame altera la carica complessiva della proteina, il che consente la caratterizzazione di questi complessi utilizzando l'elettroforesi capillare di affinità.

Per iniziare, prendi un sottile capillare di vetro pre-condizionato con gruppi silanolo carichi sulla superficie interna. Sciacquare il capillare con una soluzione di EDTA. L'EDTA è un agente chelante che rimuove le impurità degli ioni metallici. Ora, iniettare idrodinamicamente la soluzione campione contenente la proteina desiderata nel capillare dalla sua estremità positiva o anodo.

Applicare un'alta tensione per creare un flusso elettro-osmotico, costringendo le proteine nella loro conformazione nativa con cariche intrinseche a muoversi all'interno del capillare verso il catodo. Registrare il modello di migrazione delle proteine non legate dal capillare.

Successivamente, introdurre una soluzione di ligando specifica nel capillare insieme ai campioni di proteine e applicare la stessa tensione. All'interno del capillare, le molecole del ligando si legano in modo non covalente alla proteina bersaglio, formando complessi.

Ciò induce un cambiamento conformazionale nelle proteine, portando ad un'alterazione delle loro cariche intrinseche e, influenzando il rapporto carica-dimensione. Questi cambiamenti modulano le loro interazioni con la superficie carica del capillare, facendoli fluire in modo diverso rispetto alla proteina non legata.

Registrare questi cambiamenti nella mobilità elettroforetica, che sono correlati con la forza dell'interazione proteina-ligando.

Dopo aver preparato il metodo per le misurazioni senza ligandi, preparare il metodo per le misurazioni con i ligandi, utilizzando prima una soluzione di EDTA 0,1 molare per sciacquare il capillare a 2,5 bar per 1 minuto. Quindi, utilizzare acqua deionizzata per sciacquare il capillare. Quindi, equilibrare il capillare utilizzando la soluzione di legante per risciacquarlo a 2,5 bar per 1,5 minuti.

Quindi, iniettare la soluzione di acetanilide a 0,05 bar per 6 secondi e sostituire le fiale di ingresso e di uscita con le fiale tampone contenenti ligando. Applicare 0,05 bar per 2,4 secondi, in modo da spingere la soluzione di acetanilide più in profondità dalla punta del capillare. Applicare 10,0 kilovolt per 6 minuti e rilevare il picco di acetanilide a una lunghezza d'onda di 200 nanometri.

Dopo aver risciacquato il capillare con EDTA, acqua deionizzata e la soluzione di ligando come prima, iniettare il campione proteico e sostituire le fiale di ingresso e di uscita con fiale tampone fresche contenenti ligando. Infine, ripetere le misurazioni con e senza ligandi.