L'applicazione di permanente legatura dell'arteria cerebrale media nel mouse
25 luglio 2011
Dell'arteria cerebrale media (MCA) legatura è una tecnica per lo studio ischemia cerebrale focale in modelli animali. In questo metodo, l'arteria cerebrale media è esposta da craniotomia e legato da cauterizzazione. Questo metodo dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili.
L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'ischemia cerebrale focale in modelli animali. Ciò si ottiene praticando prima una piccola incisione sulla pelle tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio. Successivamente, viene eseguita una craniotomia alla giunzione dell'arco zigomatico e dell'osso squamale per esporre l'arteria cerebrale media, l'arteria cerebrale media viene quindi legata utilizzando un cauterizzatore di piccoli vasi.
Infine, la pelle viene suturata per chiudere la ferita. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un infarto situato nell'emisfero sinistro del cervello del topo. Il cervello può essere colorato con TTC o scansionato utilizzando la risonanza magnetica per la visualizzazione di un ictus.
Lo stroke brain può essere utilizzato anche per la determinazione dell'espressione di proteine o mRNA. Ciao, sono Garza Chola. Sono uno studente laureato nel laboratorio di Gale Johnson all'Università di Rochester.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ictus, come illustrare i meccanismi che portano alla cellula che nel cervello ischemico. Per prepararsi all'intervento chirurgico, sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici, le spugne di garza e gli applicatori cognitivi. Conservare gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% durante l'intervento e asciugare all'aria su una garza sterile subito prima dell'uso.
Spruzzare l'area di lavoro con etanolo al 70% due ore prima dell'intervento. Iniettare nel topo 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina. Il farmaco verrà somministrato nuovamente immediatamente dopo l'intervento chirurgico e quindi ogni tre-cinque ore durante il primo periodo postoperatorio di 24 ore.
Utilizzare un vaporizzatore anestetico per anestetizzare il topo con una miscela di fluoro ISO al 3% e ossigeno gassoso al 20%. Regolare la quantità di ossigeno con un flussometro. Testare il livello di anestesia pizzicando le dita dei piedi o la coda.
Mantenere il livello di anestesia con il 2% di fluoro ISO. Applicare lacrime artificiali sugli occhi del topo e prestare attenzione per evitare di danneggiare l'occhio. Durante la procedura chirurgica.
Posiziona il mouse sul lato destro in posizione laterale utilizzando le tosatrici per animali. Radere l'area sul lato sinistro tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio sinistro. Detergere l'area alternando una soluzione di Betadine e etanolo al 70% utilizzando applicatori con punta di cotone e strofinando leggermente l'area.
La ripetizione è necessaria. Posizionare il mouse su un termoforo collegato a una sonda rettale Per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius, inserire la sonda rettale utilizzando olio minerale. Posizionare il mouse sul lato destro sotto il microscopio e fissarlo con del nastro adesivo.
Taglia una finestra con una spugna di garza e copri l'area chirurgica con forbici dritte sottili. Fai un'incisione verticale tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio sinistro. Utilizzare emostatici curvi per mantenere aperta l'area chirurgica se si verifica un'eccessiva secchezza del tessuto durante l'intervento chirurgico.
Utilizzare applicatori con punta di cotone per applicare PBS sterile. Usa le forbici a molla per praticare un'incisione orizzontale sul muscolo temporale e tira lentamente con una pinza per separare leggermente il muscolo temporale dal cranio. Tenere l'osso mascellare con una pinza curva e utilizzare un ago calibro 18 per eseguire una piccola craniotomia subtemporale all'incrocio tra l'arco zigomatico e l'osso della suola dello squam.
Con l'osso espulso, i giurati rimuovono piccoli pezzi del cranio per esporre l'MCA. L'arco zigomatico e il contenuto orbitale non devono essere danneggiati durante questo processo. Utilizzando un cauterizzatore per piccoli vasi, legare la parte distale dell'MCA, riposizionare il muscolo temporale nella sua posizione originale e utilizzare cinque suture di nylon zero.
Per chiudere il sito dell'incisione, interrompere l'anestesia e rimuovere la sonda rettale. Iniettare nel topo una seconda dose di buprenorfina per via sottocutanea. Rimetti il topo nella gabbia, che è stata mantenuta a 37 gradi Celsius.
Con un pannello riscaldante. Monitorare attentamente il mouse per le successive 24 ore per eventuali disagi, tra cui diminuzione dell'appetito o del consumo di acqua, postura curva, aumento della respirazione o peli eretti. Fornire al topo il gel di recupero subito dopo l'intervento.
Attendere due o tre ore dopo l'intervento. Quindi iniettare nel topo buprenorfina per via sottocutanea ogni tre-cinque ore fino a 24 ore. 24 ore dopo l'intervento, anestetizzare profondamente il topo e perfondere il topo con il 4% di TTC.
Rimuovere il cervello e metterlo in una soluzione di aldeide paraforme al 4% durante la notte. Il giorno successivo, posiziona il cervello nel blocco di sezionamento. Usa le lame di rasoio per tagliare il cervello a fette spesse un millimetro.
Posiziona le fette accanto a un righello in scala millimetrica. Utilizzando una fotocamera digitale collegata a un microscopio da dissezione. Fotografa le fette nel software Image J.
Fare clic sul menu file e aprire la foto desiderata. Fare clic sulla scheda della linea retta nel programma. Disegna una linea retta tra i due margini del righello.
Fare clic sul menu Analizza e selezionare Imposta scala. Impostate la distanza nota su uno e l'unità di lunghezza su millimetri. Fare clic sulla scheda del cerchio a mano libera.
Disegna un cerchio per delineare l'emisfero controlaterale. Fare clic sul menu Analizza e selezionare la misura. Apparirà la finestra di calcolo che mostra l'area del cerchio disegnato.
Disegna un altro cerchio attorno all'emisfero omolaterale, escludendo l'area del tratto bianco. Misurare l'area come mostrato in precedenza. Il nuovo valore verrà aggiunto alla finestra di calcolo.
La differenza tra il primo e il secondo valore rappresenta l'area dell'infarto. Calcolate l'area del tratto in ogni fetta ripetendo i passaggi precedenti per spessori di fetta di un millimetro. Calcola il volume della corsa sommando l'area della corsa calcolata in ciascuna sezione.
Questa figura mostra il cervello colorato TTC 24 ore dopo la legatura permanente dell'MCA in un topo selvatico C 57 BL six. Il sito dell'ictus ha un aspetto bianco e può essere visto da diversi ingrandimenti e angolazioni. Qui sono mostrate fette spesse un millimetro del cervello dell'ictus colorato TTC dall'infarto anteriore a quello posteriore.
Il volume è stato calcolato 24 ore dopo l'intervento. Il volume dell'infarto è di circa 23 millimetri cubi Una volta senape. Questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente.
Grazie per l'attenzione.
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Panoramica
La tecnica di legatura dell'arteria cerebrale media (MCA) viene utilizzata per studiare l'ischemia cerebrale focale nei modelli animali. Questo metodo prevede l'esposizione e la legatura dell'arteria cerebrale media, determinando volumi di infarto riproducibili e un miglioramento dei tassi di sopravvivenza post-operatoria.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sull'ictus
- Modelli animali
Sfondo
- L'ischemia cerebrale focale è un ambito fondamentale per comprendere l'ictus.
- Il metodo di legatura dell'arteria cerebrale media consente sperimentazioni controllate.
- I modelli animali forniscono informazioni sui meccanismi dell'ictus umano.
- Tassi di sopravvivenza migliorati aumentano l'affidabilità dei risultati.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dell'ischemia cerebrale focale.
- Valutare i volumi di infarto in un contesto controllato.
- Migliorare la comprensione della patologia dell'ictus.
Metodi Utilizzati
- Incisione eseguita tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio.
- Craniotomia eseguita a livello dell'arco zigomatico e dell'osso squamoso.
- Arteria cerebrale media legata utilizzando un cauterizzatore per piccoli vasi.
- La cute è stata suturata per chiudere la ferita al termine della procedura.
Risultati principali
- Infarto localizzato nell'emisfero sinistro del cervello del topo.
- La visualizzazione dell'ictus è stata ottenuta mediante colorazione con TTC o risonanza magnetica (MRI).
- I risultati dimostrano l'efficacia della tecnica di legatura dell'arteria cerebrale media (MCA).
- È stata osservata un'elevata riproducibilità dei volumi di infarto.
Conclusioni
- La legatura dell'arteria cerebrale media è un metodo affidabile per lo studio dell'ischemia cerebrale focale.
- Tassi di sopravvivenza più elevati contribuiscono alla validità dei risultati.
- Questa tecnica può essere utilizzata per approfondire le ricerche sulle terapie contro l'ictus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello di legatura permanente dell'arteria cerebrale media fornisce un sistema riproducibile per lo studio dell'ischemia cerebrale focale, consentendo la riduzione del rischio meccanicistico di composti neuroprotettivi nella ricerca preclinica sull'ictus. Generando volumi di infarto costanti nei topi, questo metodo supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo sviluppo di saggi per candidati terapeutici rivolti a bisogni insoddisfatti nell'ictus ischemico. La sua rilevanza rispetto alla patologia umana—dove circa l'80% degli ictus si verifica nel territorio dell'arteria cerebrale media—migliora la fiducia traslazionale e il triage del portafoglio nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche nei percorsi ischemici mediante l'induzione controllata di ischemia focale.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico chiarificando il coinvolgimento del bersaglio nella formazione del core dell'infarto e della penombra.
- Valore operativo: Consente una quantificazione riproducibile dell'infarto tramite colorazione con TTC, facilitando la valutazione costante dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti, stabilendo un modello di ischemia rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione dell'infarto mediante volumetria basata sul TTC, consentendo analisi quantitative di risposta dose-dipendente.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità del saggio con tassi di sopravvivenza di circa l'80%, riducendo la variabilità nei risultati farmacologici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella la patologia dell'ictus umano con elevata rilevanza anatomica e fisiopatologica per le infarti nel territorio dell'arteria cerebrale media.
- Valore scientifico: Permette la valutazione in vivo dei meccanismi di risposta all'ipossia intracellulare, favorendo la scoperta di biomarcatori.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, grazie a protocolli chirurgici e di colorazione standardizzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto leader fino alla sperimentazione dell'efficacia preclinica, fornendo una piattaforma per la riduzione del rischio meccanicistico dei farmaci per l'ictus.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli neuroprotettivi consentendo un danno ischemico controllato e la quantificazione dell'infarto.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante colorazione standardizzata con TTC, producendo output quantitativi del volume dell'infarto per la valutazione dei composti.
- Analisi: Genera misurazioni volumetriche (ad esempio, infarto di ~23 mm³ a 24 h) che permettono il confronto tra diverse condizioni e la determinazione dell'entità dell'effetto.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la localizzazione dell'infarto che rispecchia i modelli di ictus umano, favorendo un avanzamento adeguato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per la valutazione di più composti in diversi progetti grazie alla sua riproducibilità e ai parametri di valutazione standardizzati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi ischemici.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di craniotomia, legatura e colorazione con TTC.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati affidabili sull'infarto, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi per l'ictus.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati neuroprotettivi sulla base di segnali di efficacia preclinica costanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microchirurgia su roditori e identificazione neuroanatomica dell'arteria cerebrale media (MCA).
- È dipendente da strumentazione microchirurgica, inclusi cauterizzatori per vasi, tappetini riscaldanti e strumenti di sutura di precisione.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di anestesia, analgesia e monitoraggio postoperatorio.
- Comporta considerazioni di adattamento nella trasposizione delle tecniche dai modelli ratto a quelli murini, inclusi le dimensioni del filo di sutura e la precisione dell'occlusione.
- È limitato dalla necessità di endpoint terminali per effettuare la quantificazione dell'infarto mediante colorazione con TTC o risonanza magnetica (MRI).
