L'applicazione di permanente legatura dell'arteria cerebrale media nel mouse
25 luglio 2011
Dell'arteria cerebrale media (MCA) legatura è una tecnica per lo studio ischemia cerebrale focale in modelli animali. In questo metodo, l'arteria cerebrale media è esposta da craniotomia e legato da cauterizzazione. Questo metodo dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili.
L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'ischemia cerebrale focale in modelli animali. Questo viene ottenuto effettuando innanzitutto una piccola incisione cutanea tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio. Successivamente, si esegue una craniotomia all'incrocio tra l'arco zigomatico e l'osso squamoso per esporre l'arteria cerebrale media, che viene quindi legata utilizzando un cauterizzatore per piccoli vasi.
Infine, la cute viene suturata per chiudere la ferita. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un'area di infarto localizzata nell'emisfero sinistro del cervello del topo. Il cervello può essere colorato con TTC o analizzato mediante risonanza magnetica (MRI) per la visualizzazione di un ictus.
Il cervello colpito può essere utilizzato anche per la determinazione dell'espressione proteica o dell'mRNA. Ciao, sono Garza Chola. Sono uno studente laureato nel laboratorio di Gale Johnson presso l'Università di Rochester.
Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ictus, ad esempio illustrando i meccanismi che portano alla morte cellulare nel cervello ischemico. Per prepararsi all'intervento chirurgico, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, le garze e gli applicatori cognitivi mediante autoclave. Mantenere gli strumenti chirurgici nel 70% di etanolo durante l'intervento e farli asciugare all'aria su garza sterile subito prima dell'uso.
Nebulizzare la zona di lavoro con etanolo al 70% due ore prima dell'intervento chirurgico. Iniettare nel topo 0,05 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina. Il farmaco verrà somministrato nuovamente immediatamente dopo l'intervento chirurgico e successivamente ogni tre-cinque ore durante le prime 24 ore del periodo postoperatorio.
Utilizzare un vaporizzatore anestetico per anestetizzare il topo con una miscela gassosa contenente 3% di ISO fluorina e 20% di ossigeno. Regolare la quantità di ossigeno mediante un flussimetro. Verificare il livello di anestesia pizzicando l’alluce o la coda.
Mantenere il livello di anestesia con fluoruro di ISO al 2%. Applicare lacrime artificiali sugli occhi del topo e prestare attenzione a non danneggiare l'occhio durante la procedura chirurgica.
Posizionare il topo sul fianco destro in posizione laterale utilizzando le forbici per animali. Rasare l'area sul lato sinistro compresa tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio sinistro. Pulire l'area alternando una soluzione di Betadine e etanolo al 70% utilizzando applicatori di cotone e sfregando leggermente la zona.
È necessario ripetere l'operazione. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldante collegato a una sonda rettale; per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius, inserire la sonda rettale utilizzando olio minerale. Posizionare il mouse sul fianco destro sotto il microscopio e fissarlo con del nastro adesivo.
Praticare un'incisione in una garza sterile e coprire l'area chirurgica con forbici dritte fini. Eseguire un'incisione verticale tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio sinistro. Utilizzare pinze emostatiche curve per mantenere aperta l'area chirurgica in caso di eccessiva essiccazione del tessuto durante l'intervento.
Utilizzare applicatori con punta di cotone per applicare PBS sterile. Usare forbici a molla per effettuare un'incisione orizzontale sul muscolo temporale e tirare lentamente con pinze per separare leggermente il muscolo temporale dal cranio. Tenere l'osso mascellare con pinze curve e utilizzare un ago da 18 gauge per praticare una piccola craniotomia subtemporale al giunto tra arco zigomatico e osso squamoso.
Con l'osso frontale, rimuovere piccole porzioni del cranio per esporre l'arteria cerebrale media (MCA). Durante questa procedura, evitare di danneggiare l'arco zigomatico e i contenuti orbitali. Utilizzando un cauterizzatore per vasi di piccole dimensioni, legare la porzione distale dell'MCA, riposizionare il muscolo temporale nella sua posizione originale e applicare suture in nylon 5-0.
Per chiudere il sito dell'incisione, interrompere l'anestesia e rimuovere la sonda rettale. Iniettare nel topo una seconda dose di buprenorfina per via sottocutanea. Riportare il topo nella gabbia, che era stata mantenuta a 37 gradi Celsius.
Con un pannello riscaldante. Monitorare attentamente il topo per le successive 24 ore per rilevare eventuali segni di malessere, inclusi calo dell'appetito o del consumo di acqua, postura accovacciata, aumento della frequenza respiratoria o pelo irto. Fornire immediatamente al topo una gelatina di recupero dopo l'intervento chirurgico.
Attendere due o tre ore dopo l'intervento chirurgico. Quindi iniettare il topo sottocute con buprenorfina ogni tre o cinque ore fino a 24 ore. A 24 ore dall'intervento chirurgico, anestetizzare profondamente il topo e perfondere il topo con TTC al 4%.
Rimuovere il cervello e collocarlo in una soluzione di paraformaldeide al 4% per tutta la notte. Il giorno successivo, posizionare il cervello nel blocco per sezionamento. Utilizzare lame di rasoio per tagliare il cervello in fette spesse un millimetro.
Posizionare le sezioni accanto a un righello graduato in millimetri. Utilizzando una fotocamera digitale collegata a un microscopio stereoscopico, fotografare le sezioni nel software J.
Fare clic sul menu file e aprire la foto desiderata. Fare clic sulla scheda della linea retta nel programma. Tracciare una linea retta tra i due margini del righello.
Fare clic sul menu analizza e selezionare imposta scala. Impostare la distanza nota pari a uno e l'unità di lunghezza come millimetro. Fare clic sulla scheda cerchio a mano libera.
Tracciare un cerchio per delineare l'emisfero controlaterale. Fare clic sul menu Analizza e selezionare Misura. Apparirà una finestra di calcolo che mostra l'area del cerchio tracciato.
Tracciare un altro cerchio attorno all'emisfero controlaterale, escludendo l'area con il tratto bianco. Misurare l'area come mostrato in precedenza. Il nuovo valore verrà aggiunto alla finestra di calcolo.
La differenza tra il primo e il secondo valore rappresenta l'area dell'infarto. Calcolare l'area dell'ictus in ogni sezione ripetendo i passaggi sopra descritti per spessori di sezione di un millimetro. Calcolare il volume dell'ictus sommando le aree dell'ictus calcolate in ciascuna sezione.
Questa figura mostra il cervello colorato con il TTC a 24 ore dalla legatura permanente dell'arteria cerebrale media in un topo di tipo selvatico C57BL/6. La zona dell'ictus appare bianca ed è visibile a diverse ingrandimenti e angolazioni. Qui sono mostrate sezioni del cervello con ictus colorate al TTC, spesse un millimetro, dall'infarto anteriore a quello posteriore.
Il volume è stato calcolato 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Il volume dell'infarto è di circa 23 millimetri cubi Una volta. Questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se effettuata correttamente.
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Panoramica
La tecnica di legatura dell'arteria cerebrale media (MCA) viene utilizzata per studiare l'ischemia cerebrale focale nei modelli animali. Questo metodo prevede l'esposizione e la legatura dell'arteria cerebrale media, determinando volumi di infarto riproducibili e un miglioramento dei tassi di sopravvivenza post-operatoria.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sull'ictus
- Modelli animali
Sfondo
- L'ischemia cerebrale focale è un ambito fondamentale per comprendere l'ictus.
- Il metodo di legatura dell'arteria cerebrale media consente sperimentazioni controllate.
- I modelli animali forniscono informazioni sui meccanismi dell'ictus umano.
- Tassi di sopravvivenza migliorati aumentano l'affidabilità dei risultati.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dell'ischemia cerebrale focale.
- Valutare i volumi di infarto in un contesto controllato.
- Migliorare la comprensione della patologia dell'ictus.
Metodi Utilizzati
- Incisione eseguita tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio.
- Craniotomia eseguita a livello dell'arco zigomatico e dell'osso squamoso.
- Arteria cerebrale media legata utilizzando un cauterizzatore per piccoli vasi.
- La cute è stata suturata per chiudere la ferita al termine della procedura.
Risultati principali
- Infarto localizzato nell'emisfero sinistro del cervello del topo.
- La visualizzazione dell'ictus è stata ottenuta mediante colorazione con TTC o risonanza magnetica (MRI).
- I risultati dimostrano l'efficacia della tecnica di legatura dell'arteria cerebrale media (MCA).
- È stata osservata un'elevata riproducibilità dei volumi di infarto.
Conclusioni
- La legatura dell'arteria cerebrale media è un metodo affidabile per lo studio dell'ischemia cerebrale focale.
- Tassi di sopravvivenza più elevati contribuiscono alla validità dei risultati.
- Questa tecnica può essere utilizzata per approfondire le ricerche sulle terapie contro l'ictus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello di legatura permanente dell'arteria cerebrale media fornisce un sistema riproducibile per lo studio dell'ischemia cerebrale focale, consentendo la riduzione del rischio meccanicistico di composti neuroprotettivi nella ricerca preclinica sull'ictus. Generando volumi di infarto costanti nei topi, questo metodo supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e lo sviluppo di saggi per candidati terapeutici rivolti a bisogni insoddisfatti nell'ictus ischemico. La sua rilevanza rispetto alla patologia umana—dove circa l'80% degli ictus si verifica nel territorio dell'arteria cerebrale media—migliora la fiducia traslazionale e il triage del portafoglio nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche nei percorsi ischemici mediante l'induzione controllata di ischemia focale.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico chiarificando il coinvolgimento del bersaglio nella formazione del core dell'infarto e della penombra.
- Valore operativo: Consente una quantificazione riproducibile dell'infarto tramite colorazione con TTC, facilitando la valutazione costante dell'interazione con il bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti, stabilendo un modello di ischemia rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione dell'infarto mediante volumetria basata sul TTC, consentendo analisi quantitative di risposta dose-dipendente.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità del saggio con tassi di sopravvivenza di circa l'80%, riducendo la variabilità nei risultati farmacologici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella la patologia dell'ictus umano con elevata rilevanza anatomica e fisiopatologica per le infarti nel territorio dell'arteria cerebrale media.
- Valore scientifico: Permette la valutazione in vivo dei meccanismi di risposta all'ipossia intracellulare, favorendo la scoperta di biomarcatori.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, grazie a protocolli chirurgici e di colorazione standardizzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto leader fino alla sperimentazione dell'efficacia preclinica, fornendo una piattaforma per la riduzione del rischio meccanicistico dei farmaci per l'ictus.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli neuroprotettivi consentendo un danno ischemico controllato e la quantificazione dell'infarto.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante colorazione standardizzata con TTC, producendo output quantitativi del volume dell'infarto per la valutazione dei composti.
- Analisi: Genera misurazioni volumetriche (ad esempio, infarto di ~23 mm³ a 24 h) che permettono il confronto tra diverse condizioni e la determinazione dell'entità dell'effetto.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la localizzazione dell'infarto che rispecchia i modelli di ictus umano, favorendo un avanzamento adeguato al rischio.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per la valutazione di più composti in diversi progetti grazie alla sua riproducibilità e ai parametri di valutazione standardizzati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi ischemici.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso procedure standardizzate di craniotomia, legatura e colorazione con TTC.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo dati affidabili sull'infarto, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi per l'ictus.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati neuroprotettivi sulla base di segnali di efficacia preclinica costanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microchirurgia su roditori e identificazione neuroanatomica dell'arteria cerebrale media (MCA).
- È dipendente da strumentazione microchirurgica, inclusi cauterizzatori per vasi, tappetini riscaldanti e strumenti di sutura di precisione.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di anestesia, analgesia e monitoraggio postoperatorio.
- Comporta considerazioni di adattamento nella trasposizione delle tecniche dai modelli ratto a quelli murini, inclusi le dimensioni del filo di sutura e la precisione dell'occlusione.
- È limitato dalla necessità di endpoint terminali per effettuare la quantificazione dell'infarto mediante colorazione con TTC o risonanza magnetica (MRI).
