Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

Per l'elettroforesi su gel bidimensionale di una miscela proteica derivata da tessuto tumorale omogeneizzato, trattare con tampone contenente caotropi, detergente zwitterionico e agente riducente. I caotropi e i detergenti denaturano e solubilizzano le proteine. Gli agenti riducenti riducono i legami disolfuro delle proteine, generando gruppi tiolici liberi e dispiegando le proteine per una risoluzione ottimale delle proteine.

Trasferire la miscela proteica trattata in un gradiente di pH immobilizzato, IPG, portastrisce. Posizionare una striscia IPG comprendente un gradiente lineare di pH all'interno della matrice di gel di acrilammide. Aggiungere olio minerale per prevenire l'evaporazione della soluzione proteica. Trasferire il supporto in un sistema IEF a messa a fuoco isoelettrica. Lasciare che la soluzione proteica reidrati la striscia.

Eseguire l'IEF di prima dimensione. La corrente elettrica fa sì che le proteine cariche migrino attraverso il gradiente di pH verso elettrodi di carica opposta, immobilizzandosi nei rispettivi punti isoelettrici - pH al quale le proteine hanno carica netta zero.

Dopo l'IEF, trattare la striscia IPG con dodecil solfato di sodio, SDS, un detergente anionico che conferisce carica negativa alle proteine. Equilibrare con un agente alchilante per modificare i gruppi tiolici proteici, garantendo la solubilità delle proteine durante l'elettroforesi.

Caricare la striscia su un gel prefabbricato a risoluzione di poliacrilammide a pori piccoli e fissarla con agarosio fuso. Riempire le camere con un tampone per elettroforesi contenente SDS. Iniziare l'elettroforesi di seconda dimensione, perpendicolare all'IEF.

Le proteine caricate negativamente e di peso molecolare più grande si muovono lentamente attraverso il gel verso l'anodo caricato positivamente rispetto alle proteine più piccole, facilitando la separazione basata sulle dimensioni.

Macchiare il gel. Le proteine possono essere visualizzate come macchie discrete sul gel.

Per iniziare questa procedura, aggiungere 250 microlitri di una soluzione di campione proteico precedentemente preparata a ciascuna fessura di un supporto per striscia IPG da 13 centimetri. Posizionare una striscia IPG di 18 centimetri, con il lato gel rivolto verso il basso, su ciascuna soluzione di campione proteico, facendo attenzione a evitare bolle. Quindi, aggiungere da 3 a 4 millilitri di olio minerale per coprire ogni striscia IPG.

Quindi, assemblare ciascun supporto per strisce IPG in un sistema di messa a fuoco isoelettrico, con l'estremità appuntita sulla piastra posteriore e l'estremità quadrata sulla piastra anteriore. Dopo aver reidratato le strisce IPG per 18 ore a temperatura ambiente, impostare i parametri IEF sul sistema di focalizzazione isoelettrico con un'autonomia totale di 7,5 ore e 36.875 volt ora.

Dopo l'IEF, estrarre ogni striscia di IPG dal sistema di focalizzazione isoelettrico e rimuovere l'olio minerale in eccesso con un tovagliolo di carta insolubile. Quindi, avvolgi ogni striscia in un foglio di pellicola trasparente e conservala a -80 gradi Celsius.

Per colare un gel PAGE al 12%, aggiungere acqua distillata doppia, tampone tricriclorico molare da 1,5 molari, soluzione madre di acrilammide/bisacrilammide al 40%, persolfato di ammonio al 10% e TEMED in un becher. Mescolare delicatamente la soluzione in gel, facendo attenzione a evitare bolle.

Versare delicatamente la soluzione di gel in una camera di colata multipla, fino all'altezza prevista del gel di 19 centimetri. Immediatamente, aggiungere circa 3 millilitri di acqua distillata doppia alla camera di colata multipla per coprire ogni gel in risoluzione e lasciare che ogni gel polimerizzi per circa un'ora.

Questo passaggio è molto importante per preparare un gel SDS-PAGE di alta qualità. Un volume uguale di acqua deve essere immediatamente aggiunto sulla parte superiore di ogni gel.

Preparare due litri di tampone per elettroforesi, quindi aggiungere il tampone a un serbatoio tampone dell'unità di separazione per elettroforesi.

Dopo aver tolto le strisce di IPG focalizzate dal congelatore, metterle in un recipiente di plastica contenente 1 millilitro di tampone di equilibrio riducente e una traccia di blu di bromofenolo, e bilanciarle per 10 minuti con un leggero dondolio. Dopo aver rimosso il tampone di equilibrio riducente, aggiungere 4 millilitri di tampone di equilibrio di alchilazione e una traccia di blu di bromofenolo alle strisce IPG ed equilibrarle per 10 minuti con un leggero dondolio.

Durante l'equilibrio del gel, smontare la camera di multifusione e rimuovere la cassetta del gel risolutivo preparata. Sciacquare la cassetta del gel tre volte con acqua distillata doppia, quindi rimuovere l'acqua in eccesso dalla cassetta del gel con un tovagliolo di carta insolubile e posizionarla in uno stander di gel.

Successivamente, sciacquare le strisce IPG equilibrate con tampone per elettroforesi e rimuovere il liquido in eccesso su ciascuna superficie della striscia IPG con un tovagliolo di carta insolubile. Posizionare una striscia IPG sul gel SDS-PAGE risolutivo, lasciando che il lato in plastica della striscia IPG entri in contatto con la lastra di vetro più lunga, con l'estremità appuntita a sinistra.

Ora, aggiungi rapidamente da 3 a 4 millilitri di agarosio caldo all'1% e tampone per elettroforesi SDS, per sigillare la striscia IPG sulla parte superiore di ogni gel SDS-PAGE, e posiziona il lato superiore della striscia IPG sulla parte superiore della lastra di vetro più corta, facendo attenzione a evitare bolle.

Questi passaggi sono molto importanti per sigillare la striscia IPG su un gel SDS-PAGE. Le soluzioni calde di agarosio devono essere aggiunte immediatamente e la striscia IPG deve essere immediatamente inserita nella parte superiore del gel SDS.

Dopo la polimerizzazione, inserire la cassetta di gel assemblata verticalmente tra le guarnizioni in plastica e un sistema di elettroforesi verticale. Posizionare la parte superiore del gel con la striscia IPG accanto al catodo. Quindi, regolare il livello del tampone per elettroforesi per immergere la cassetta del gel aggiungendo il volume appropriato di tampone al sistema di elettroforesi.

Collegare e impostare l'alimentatore in modalità tensione costante e farlo funzionare a 200 volt per circa 370 minuti monitorando il colorante. Al termine della corsa, estrarre la cassetta del gel dal sistema di elettroforesi e rimuovere delicatamente il gel dalla cassetta del gel, facendo attenzione a non strappare il gel.