Elettroforesi su gel per zimografia: una tecnica elettroforetica per rilevare le metalloproteinasi della matrice valutando l'attività enzimatica

La metalloproteinasi della matrice, o MMP, una proteasi multidominio che comprende domini propeptidici e catalitici, è secreta come enzima inattivo o zimogeno da cellule specifiche. L'interazione tra lo ione zinco del dominio catalitico e il residuo di cisteina del dominio propeptidico mantiene inattiva la MMP.

Per rilevare le MMP nel surnatante di coltura cellulare mediante elettroforesi su gel per zimografia, riempire il serbatoio per elettroforesi contenente cassetta di gel con dodecil solfato di sodio o tampone di corsa contenente SDS.

Caricare il surnatante di coltura miscelato con il tampone di caricamento, seguito dagli standard proteici, in pozzetti di gel di poliacrilammide, copolimerizzato con un substrato proteico specifico per MMP.

La SDS, un detergente caricato negativamente, in condizioni non riducenti, interrompe le interazioni cisteina-zinco nelle MMP e denatura le proteine mentre conferisce una carica negativa.

Eseguire l'elettroforesi. Il campo elettrico fa sì che le proteine caricate negativamente migrino verso l'anodo caricato positivamente, causando la separazione delle proteine in base alle dimensioni.

Dopo l'elettroforesi, trattare il gel con un tampone rinaturante contenente detergente non ionico. I detergenti non ionici sostituiscono la SDS, rinaturalizzando le proteine e ripristinando parzialmente l'attività delle MMP. Gli MMP vengono ulteriormente elaborati in uno stato completamente attivo.

Incubare in un tampone di sviluppo contenente cationi metallici bivalenti essenziali per l'attività delle MMP. Le MMP attive, insieme ai cationi, digeriscono il substrato MMP nel gel. Lavare il gel per rimuovere i prodotti digeriti. Macchiare il gel.

Le aree di attività delle MMP, prive di substrato delle MMP, appaiono come bande chiare su uno sfondo blu scuro di substrato non digerito. Utilizzando un software adatto, l'intensità della banda di gel può essere correlata all'attività MMP.

Prima dell'inizio di questo protocollo, preparare adeguatamente tutte le metalloproteinasi della matrice, o MMP, per mantenere la funzione degli enzimi. I campioni possono essere utilizzati immediatamente o conservati a -80 gradi Celsius. Qui la MMP-2, nota anche come gelatinasi A o collagenasi di tipo IV, viene utilizzata per dimostrare la visualizzazione dell'attività delle MMP con la zimografia.

Una volta preparati gli enzimi MMP, procurarsi una busta di gel zimogramma di gelatina al 10% contenente un gel all'interno di una cassetta. Sciacquare la cassetta con acqua deionizzata. Rimuovere il nastro protettivo dalla parte inferiore della cassetta e il pettine dalla parte superiore del gel. Sciacquare i pozzetti tre volte con il tampone di corsa Tris-Glycine SDS.

Posizionare il gel in un apparecchio per elettroforesi a mini-celle, assicurandosi che il lato più piccolo della cassetta sia rivolto verso l'interno. Bloccare il gel in posizione con il cuneo di tensione del gel. Riempire la camera superiore dell'apparecchio con tampone di corsa Tris-Glycine SDS sopra il livello dei pozzetti e verificare la presenza di eventuali perdite. Riempire anche la camera inferiore del set-up per elettroforesi su gel con il tampone di corsa.

Quindi, caricare 10 microlitri di marcatore molecolare proteico.

Miscelare una quantità uguale di campione in un tampone di caricamento gel che non contenga agenti riducenti. A differenza della normale SDS-PAGE, non far bollire i campioni e caricarli direttamente nei pozzetti del gel, utilizzando i puntali di caricamento del gel. Questi pozzetti possono contenere fino a 20 microlitri di volume.

Posizionare il coperchio sulla minicella e collegare i cavi degli elettrodi all'alimentatore. Accendere l'alimentazione e impostare il gel in modo che funzioni a 125 volt, costante per 90 minuti. Verificare la formazione di piccole bolle sul filo della camera inferiore, che indicano la circolazione di corrente.

Quando si esegue il primo gel, monitorare l'avanzamento della migrazione ogni 15 minuti, utilizzando come indicatore il blu di bromofenolo incluso nel tampone di caricamento. Per ogni gel, preparare 100 millilitri di tampone 1X per la rinaturalizzazione dello zimogramma e 200 millilitri di tampone per lo sviluppo dello zimogramma, entrambi in acqua deionizzata.

Quando il colorante tracciante blu bromofenolo raggiunge il fondo del gel, spegnere l'alimentazione.

Aprire la mini-cella e rimuovere il gel. Separare i due lati della cassetta usando un coltello da gel. Taglia un angolo per segnare la direzione del gel. Rimuovere con cautela il gel dalla cassetta e metterlo in un contenitore con 100 millilitri di tampone rinaturalizzante.

Incubare il gel per 30 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente.

Rimuovere il tampone di rinaturalizzazione e aggiungere 100 millilitri di tampone di sviluppo al gel. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione.

Quindi, rimuovere il tampone di sviluppo e aggiungere altri 100 millilitri di tampone di sviluppo fresco al gel. Incubare il gel per una notte a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il tampone di sviluppo e lavare il gel incubandolo con acqua deionizzata, sotto leggera agitazione, per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio due volte.

Posizionare il gel su un foglio di plastica protettiva e rimuovere le bolle. Quindi, scansiona il gel con un foto-scanner per salvare l'esatto posizionamento delle bande standard proteiche, poiché diventeranno appena visibili dopo la colorazione del gel.

Colorare il gel aggiungendo 20 millilitri di SimplyBlue SafeStain al gel. Incubare il gel per 1 ora a temperatura ambiente, agitando delicatamente.

Rimuovere SimplyBlue SafeColoring e decolorare il gel in 100 millilitri di acqua deionizzata a temperatura ambiente con una leggera agitazione.

Dopo 1 ora, sostituire con acqua fresca deionizzata e continuare a incubare il gel per almeno un'ora.