Saggio del doppio strato lipidico supportato sferico: una tecnica per osservare l'assemblaggio della septina su microsfere

Le septine sono proteine chiave del citoscheletro che si legano alle superfici curve della membrana plasmatica.

Per osservare l'assemblaggio in vitro della septina su microsfere, in primo luogo, prendere una sospensione di microscopiche perle di silice di dimensioni uniformi, che fungono da supporto solido per la formazione del doppio strato. Agita questa sospensione per rompere eventuali grappoli di perline.

Integralo con piccole vescicole unilamellari, SUV - vescicole sferiche circondate da un singolo doppio strato lipidico. Incubare agitando costantemente, evitando che le microsfere si depositino.

Durante l'incubazione, i gruppi della testa polare esterna facilitano l'adsorbimento dei SUV sulla superficie della microsfera idrofila. Questa interazione provoca la rottura dei SUV, seguita dalla fusione dei lipidi dei SUV sulla superficie curva della microsfera come uno strato continuo, con conseguente formazione di un doppio strato lipidico sferico supportato, SLB.

Lavare per rimuovere i lipidi non legati in eccesso e risospendere nel tampone di reazione. Trasferire la sospensione SLB sferica su una piccola regione di una superficie rivestita di polietilenglicole, per evitare adsorbimenti non specifici. Aggiungere una sospensione di settina marcata in fluorescenza alla camera e incubare.

Le septine formano etero-oligomeri che riconoscono la curvatura positiva degli SLB sferici, polimerizzandosi per formare filamenti. Alla fine, i filamenti di septina interagiscono tra loro, portando alla formazione di strutture di ordine superiore.

Osservare gli SLB rivestiti di settina con un microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione. La presenza di fluorescenza indica la deposizione sensibile alla curvatura della septina.

Per prima cosa, fai vorticare la bottiglia contenente microsfere di silice per 15 secondi. Quindi, fai il bagno sonicato per un minuto e vortica di nuovo per 15 secondi per rompere eventuali ammassi. Mescolare le perle con SLBB e 10 microlitri di SUV da 5 millimolari in una provetta per microcentrifuga a bassa aderenza.

Incubare la miscela di perle e lipidi per un'ora a temperatura ambiente, su uno shaker per evitare la sedimentazione. Nel frattempo, scongelare un vetrino coprioggetti PEGilato e incollarvi una provetta PCR da 0,2 millilitri tagliata. Dopo l'incubazione, centrifugare le perle per 30 secondi presso l'RCF designato.

Dopo la prima centrifuga, rimuovere 50 microlitri di surnatante. Quindi, aggiungere 200 microlitri di PRB e miscelare con un pipettaggio vigoroso. Per i round successivi, rimuovere 200 microlitri di PRB e aggiungere altri 200 microlitri dopo il secondo e il terzo giro e aggiungere 220 microlitri di PRB dopo il quarto giro.

Se si esegue un test di competizione con perle di più dimensioni, preparare la reazione mescolando volumi uguali di ciascuna dimensione di perle e diluendo 29 microlitri di questa miscela di microsfere con 721 microlitri di tampone di reazione. Quindi, aggiungere 75 microlitri di perle diluite e 25 microlitri della proteina diluita in SSB ai pozzetti e mescolare.

Se si misurano le septine a uno stato stazionario, incubare la miscela a temperatura ambiente per un'ora, quindi acquisire l'immagine mediante microscopia quasi TIRF o confocale.