Saggio di formazione di aggregati proteici: un metodo per rilevare e quantificare l'aggregazione proteica in cellule coltivate dopo induzione da parte dell'inibitore del proteasoma

La rimozione delle proteine mal ripiegate nella cellula è regolata principalmente dal sistema cellulare ubiquitina-proteasoma, in cui la proteina viene prima riconosciuta e marcata dall'ubiquitina, una piccola proteina regolatrice, e trasportata al proteasoma, un complesso multiproteico, per l'idrolisi e la clearance.

L'alterata attività del sistema ubiquitina-proteosoma, un evento comune nelle malattie neurodegenerative, può causare l'accumulo di proteine mal ripiegate all'interno delle cellule, formando aggregati proteici insolubili con effetti citotossici.

Per visualizzare e quantificare l'aggregazione proteica in vitro, ottenere una sospensione di cellule di mammifero trasdotte - che esprimono una proteina mutante marcata con fluorescenza che adotta una conformazione mal ripiegata con residui idrofobici esposti - in terreni adatti.

Pipettare le concentrazioni crescenti di un inibitore del proteasoma nei pozzetti di una piastra nera a più pozzetti per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo durante l'imaging. Seminare la sospensione cellulare di mammifero nei pozzetti. Incubare per consentire alle cellule di aderire al fondo della piastra e proliferare.

Una volta all'interno, l'inibitore del proteasoma si lega ai siti proteolitici del proteasoma e ne blocca l'attività, provocando l'accumulo delle proteine mutanti espresse, che poi interagiscono attraverso i loro residui idrofobici esposti e formano aggregati citoplasmatici, portando infine alla morte cellulare.

Aggiungi un colorante fluorescente legante il DNA per colorare i nuclei cellulari. Immagina la targa. Gli aggregati proteici mutanti fluorescenti appaiono dispersi all'interno del citoplasma non colorato.

I pozzetti contenenti concentrazioni più elevate di inibitori del proteasoma mostrano un numero più elevato di aggregati proteici rispetto al rapporto tra inibitori del proteasoma e cellulari più bassi rispetto ai pozzetti con concentrazioni più basse di inibitori del proteasoma.

Per il trasferimento del composto, su una piastra in polipropilene di stoccaggio a 384 pozzetti, aggiungere diluizioni seriali dei composti secondo la serie standard di diluizione da 1 a 3. Quindi, utilizzando un gestore di liquidi dotato di una testa capillare a 384, distribuire 0,25 microlitri di inibitori del proteasoma su piastre di saggio nere a 384 pozzetti vuote a fondo piatto. Quindi, semina 1,5 x 10⁴ celle su queste piastre. Incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore.

Prima di eseguire l'imaging della linea cellulare trattata con inibitori del proteasoma, aggiungere 10 microlitri di DMEM preriscaldato con soluzione colorante e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Dopo la colorazione, avviare il software operativo del microscopio automatizzato selezionando la scheda "Microscopio". Innanzitutto, seleziona la scheda "Configurazione", quindi seleziona l'obiettivo 20X e il tipo di targa corretto.

Per consentire una messa a fuoco corretta con diversi tipi di piastre, assicurarsi che il "Collare" sia impostato sul valore corretto sull'obiettivo.

Quindi, seleziona "Esposizione 1", imposta l'altezza di messa a fuoco su "0 micrometri", quindi seleziona "Messa a fuoco". Una volta messa a fuoco, esporre Fotocamera 1.

Per ottimizzare il piano di esposizione, regolare l'altezza di messa a fuoco e fare clic su "Prendi altezza". Modificare i tempi di esposizione della potenza laser per un'intensità massima di pixel di circa 3.000 e salvare i parametri di esposizione.

Seleziona la scheda "Definizione esperimento". Crea un layout e un sottolayout. Quindi, trascina e rilascia il layout pertinente, l'esposizione, l'immagine di riferimento, il file di ritaglio inclinato e il sottolayout. Quindi, salva l'esperimento.

Infine, seleziona la scheda "Esperimento automatico" e acquisisci le immagini. Per le immagini a 2 canali, selezionare prima l'algoritmo software per segmentare gli oggetti primari, come nuclei, citosol e aggregati.