JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:12 min. • July 8th, 2025
La rimozione delle proteine mal ripiegate nella cellula è regolata principalmente dal sistema cellulare ubiquitina-proteasoma, in cui la proteina viene prima riconosciuta e marcata dall'ubiquitina, una piccola proteina regolatrice, e trasportata al proteasoma, un complesso multiproteico, per l'idrolisi e la clearance.
L'alterata attività del sistema ubiquitina-proteosoma, un evento comune nelle malattie neurodegenerative, può causare l'accumulo di proteine mal ripiegate all'interno delle cellule, formando aggregati proteici insolubili con effetti citotossici.
Per visualizzare e quantificare l'aggregazione proteica in vitro, ottenere una sospensione di cellule di mammifero trasdotte - che esprimono una proteina mutante marcata con fluorescenza che adotta una conformazione mal ripiegata con residui idrofobici esposti - in terreni adatti.
Pipettare le concentrazioni crescenti di un inibitore del proteasoma nei pozzetti di una piastra nera a più pozzetti per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo durante l'imaging. Seminare la sospensione cellulare di mammifero nei pozzetti. Incubare per consentire alle cellule di aderire al fondo della piastra e proliferare.
Una volta all'interno,
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