Saggio di imaging con sonda fluorescente: una tecnica per visualizzare lo stress ossidativo nelle cellule organoidi intestinali in coltura trattate con induttore di specie reattive dell'ossigeno

Gli organoidi intestinali ricapitolano l'organizzazione cripto-villo-intestinale con un lume centrale che comprende cellule morte e detriti. Il lume è rivestito da cellule simili a villi e sporgenze in gemmazione, simili a cripte, che ospitano cellule staminali.

Diverse cellule organoidi producono livelli variabili di specie reattive dell'ossigeno, ROS - sottoprodotti delle attività metaboliche, il cui accumulo porta allo stress ossidativo.

Per visualizzare lo stress ossidativo in varie cellule, iniziare prendendo una piastra multipozzetto contenente organoidi 3D coltivati in una matrice basamentale. Le cellule staminali dell'organoide esprimono una proteina a fluorescenza verde o proteina marcata GFP che aiuta a distinguerle durante l'imaging.

Integrare i pozzetti con terz-butile idroperossido - un induttore dei ROS - e incubare. L'induttore attiva la NADPH ossidasi legata alla membrana e stimola la produzione di ROS all'interno delle cellule. Le cellule staminali, essendo metabolicamente attive, producono più ROS rispetto alle cellule differenziate.

Aggiungere sonde fluorogeniche sensibili ai ROS. Queste sonde lipofile entrano rapidamente nelle cellule e reagiscono con i ROS per