JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:00 min. • July 8th, 2025
I neurotrasmettitori monoamminici, messaggeri chimici endogeni, trasmettono segnali attraverso la sinapsi, il punto di contatto tra i neuroni. Il sistema di neurotrasmettitori monoamminici strettamente regolato è essenziale per la normale funzione neuronale.
Per esaminare l'effetto di un farmaco in esame sul rilascio di monoammine ex vivo, ottenere fette di tessuto cerebrale di ratto contenenti la regione di interesse in un tampone ossigenato refrigerato, mantenendo la vitalità tissutale.
Trasferire le fette di tessuto nei pozzetti di una piastra a più pozzetti, con inserti filtranti porosi collegati a una miscela gassosa e comprendente liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, aCSF, integrato con inibitori delle monoaminossidasi. Incubare.
Gli inibitori si diffondono nelle cellule e inattivano gli enzimi monoaminossidasi, prevenendo la degradazione delle monoammine e aumentando la loro concentrazione disponibile per lo stoccaggio e il rilascio.
Trasferire gli inserti contenenti tessuto in pozzetti comprendenti aCSF ossigenato e il farmaco in esame. Incubare. Il farmaco può stimolare il sistema di neurotrasmettitori monoamminici, aumentando la concentrazione di monoammine nello spazio extraneuronale, portando al loro rilascio dal tessuto cerebrale in soluzione.
Le monoammine rilasciate passano attraverso gli inserti porosi nei pozzetti, separandosi dal tessuto.
Dopo l'incubazione, rimuovere la fetta di tessuto contenente gli inserti. Raccogliere la soluzione monoamminica in una provetta contenente un solvente compatibile con la cromatografia liquida ad alte prestazioni, HPLC. Trasferire il contenuto del tubo in unità filtranti preassemblate. Centrifuga, rimozione dei principali contaminanti.
Caricare il filtrato ottenuto nella colonna HPLC ed eseguire una cromatografia per determinare la concentrazione di monoammine, indicativa dell'effetto del farmaco in esame sul rilascio di monoammine.
Per indurre il rilascio di monoammine, trasferire i campioni di tessuto in ciascun pozzetto di una camera di efflusso a 48 pozzetti su misura, contenente da 0,5 a 1 millilitro di tampone di efflusso per pozzetto con gorgogliamento costante e delicato, e lasciare che i campioni si riprendano per 30-50 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine del periodo di equilibratura, spostare il portatessuto con il tessuto cerebrale, in pozzetti contenenti 500 microlitri di tampone di efflusso ossigenato con o senza agente farmacologico, picchiettando il supporto sul bordo del pozzetto per evitare il minimo trasferimento di tampone tra i pozzetti, per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, spostare il supporto in una nuova serie di pozzetti contenenti 500 microlitri di tampone di efflusso con o senza il farmaco di interesse e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari, per altri 20 minuti.
Durante la seconda incubazione, trasferire la soluzione dai pozzetti della prima incubazione in provette da microcentrifuga contenenti 50 microlitri di acido perclorico o fosforico 1 N su ghiaccio ed etichettare le provette #1.
Al termine della seconda incubazione, spostare il supporto del tessuto in pozzetti vuoti con la piastra su ghiaccio e trasferire i surnatanti dalla seconda incubazione in nuove provette da microcentrifuga contenenti 50 microlitri di acido perclorico o fosforico 1 N, su ghiaccio. Etichetta questi tubi #2.
Quando tutti i surnatanti sono stati trasferiti, aggiungere 1 millilitro di tampone di dissezione ghiacciato a ciascun pozzetto di tessuto e utilizzare piccole pinzette per trasferire ogni campione di tessuto in una nuova provetta da microcentrifuga. Rimuovere il tampone dalle provette del campione e conservare i tessuti a una temperatura di -80 gradi Celsius. Quindi, trasferire le soluzioni di incubazione raccolte in provette filtranti per microcentrifuga per la centrifugazione e posizionare il filtrato sul ghiaccio, fino all'analisi HPLC.