Saggio di aggregazione PolyQ per identificare l'effetto neuroprotettivo di un composto nei vermi

In alcune malattie neurodegenerative, la proteina associata alla malattia comprende un tratto espanso di poliglutammina, polyQ, - una stringa di residui consecutivi di glutammina - ed è conformata in modo aberrante. La conformazione alterata destabilizza l'omeostasi proteica, causando l'accumulo di proteine e la formazione di aggregati tossici, portando alla disfunzione neuronale e alla morte.

Per esaminare la capacità protettiva di un composto in esame nell'alleviare la proteotossicità associata all'aggregazione polyQ, ottenere una sospensione di larve transgeniche di Caenorhabditis elegans che esprimono proteine polyQ marcate in fluorescenza nelle cellule muscolari della parete corporea.

Prelevare una piastra a più pozzetti contenente terreni integrati con cibo batterico. Aggiungere il composto di prova in una serie di pozzetti. Trasferire le larve nella piastra a più pozzetti. Sigillare la piastra per evitare la disidratazione del terreno e la contaminazione microbica. Incubare, permettendo alle larve di crescere fino a diventare adulte.

Durante lo sviluppo, con l'invecchiamento del nematode, le proteine polyQ si accumulano progressivamente all'interno delle cellule muscolari e formano aggregati.

Se il composto in esame è presente nel terreno, entra nelle cellule muscolari e, a seconda della sua capacità protettiva, può esercitare un effetto anti-aggregazione polyQ, sopprimendo e ritardando l'aggregazione polyQ.

Raccogliere i nematodi adulti e centrifugare. Risospendere i nematodi pellettati. Trasferire in una piastra a più pozzetti. Immobilizzare i nematodi usando l'azide di sodio.

Utilizzando un dispositivo a fluorescenza ad alta risoluzione, contare i punti fluorescenti, che rappresentano gli aggregati polyQ, per nematode.

Un numero medio inferiore di aggregati polyQ nel trattamento rispetto ai pozzetti di controllo suggerisce una maggiore capacità protettiva del composto in esame nell'alleviare la proteotossicità associata all'aggregazione polyQ.

Inizia trasferendo da 300 a 500 larve L1 sincronizzate di nematodi AM141 in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con 500 microlitri di terreno S contenente il ceppo OP50 di E. coli e cinque milligrammi per millilitro di astragalano. Sigillare la piastra con parafilm e incubarla a 20 gradi Celsius e 120 rotazioni al minuto per gli intervalli di tempo desiderati.

Trasferire i nematodi in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e lavare con tampone M9 tre volte mediante centrifugazione, per rimuovere le cellule OP50 rimanenti. Quindi, risospendere i nematodi AM141 nel tampone M9.

Ora, trasferire da 10 a 15 nematodi in ciascun pozzetto in una piastra da 384 pozzetti, impostando 10 pozzetti di replica per ogni trattamento, e aggiungere 10 microlitri di azoturo di sodio da 200 millimolari a ciascun pozzetto, per paralizzare i nematodi consentendo loro di depositarsi sul fondo.

Posizionare la lastra in un sistema di imaging ad alto contenuto per acquisire immagini fluorescenti. Aprire il software di acquisizione delle immagini e impostare i parametri indicati nel manoscritto del testo. Analizzare i dati dell'immagine aprendo la finestra "Rivedi dati targa" e selezionando la "Piastra di prova" per l'analisi dell'immagine.

Fare doppio clic su un pozzetto di test per visualizzarne l'immagine. Quindi, seleziona "Conta nuclei" come metodo di analisi e fai clic sul pulsante "Configura impostazioni". Definisci l'immagine sorgente dal canale FITC e seleziona l'"Algoritmo standard".

Impostare i parametri di analisi dell'immagine come descritto nel manoscritto del testo e testarli per ottimizzare il metodo di analisi. Salva le impostazioni ed esegui l'analisi su tutti i pozzetti. Esportare i "nuclei totali" come numero totale di aggregati Q40::YFP in ciascun pozzetto.

Contare il numero di nematodi in ogni pozzetto e calcolare il numero medio di aggregati Q40::YFP per nematode in ciascun gruppo. Quindi, calcola l'indice di inibizione.