Saggio dell'attività del recettore degli estrogeni-reporter per lo screening dell'attività estrogenica dei fitoestrogeni

Gli estrogeni sono ormoni steroidei che agiscono come molecole di segnalazione endocrina e si legano ai recettori nucleari beta, i recettori degli estrogeni beta, formando complessi di recettori estrogeno-beta.

Questi complessi ligando-recettore dimerizzano e formano omodimeri nel citoplasma cellulare. L'omodimero risultante entra nel nucleo, si lega all'elemento di risposta agli estrogeni, ERE - una specifica sequenza di DNA all'interno del promotore del gene bersaglio - e avvia la trascrizione.

Per determinare l'attività estrogenica dei fitoestrogeni, metaboliti secondari di origine vegetale che imitano la funzione degli estrogeni, iniziare con una piastra a più pozzetti contenente cellule reporter sospese in un mezzo appropriato.

Le cellule reporter sono ingegnerizzate per sovraesprimere i recettori degli estrogeni beta e trasfettate con un gene della luciferasi fuso al promotore ERE. Aggiungere la soluzione campione contenente fitoestrogeni e incubare.

Durante l'incubazione, il fitoestrogeno si lega ai recettori degli estrogeni, beta - espressi nelle cellule reporter. Una volta legati, i complessi fitoestrogeno-recettore si dimerizzano e si traslocano nel nucleo.

All'interno del nucleo, il complesso dimerizzato si lega all'ERE. Il legame avvia la trascrizione del gene della luciferasi, producendo l'enzima luciferasi. Quindi, rimuovere il terreno e aggiungere un reagente contenente un substrato per la luciferasi. Incubare per consentire all'enzima luciferasi espresso di ossidare il suo substrato e produrre luminescenza.

Misurare la luminescenza, che conferma l'attività estrogenica del composto nel campione.

Vortice i campioni. Quindi, aggiungere 4 microlitri di ciascun campione a 496 microlitri di terreno di screening dei composti, per ottenere una soluzione di DMSO allo 0,8%.

Disinfettare la superficie esterna di una provetta di terreno di recupero cellulare preriscaldata con etanolo al 70% e trasferire 10 millilitri di terreno in una provetta di cellule reporter congelate per scongelarle. Chiudere il tubo delle cellule reporter e metterlo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 5-10 minuti.

Dopo aver recuperato le cellule dal bagnomaria, capovolgere delicatamente il tubo più volte per rompere gli aggregati di cellule e produrre una sospensione omogenea. Quindi, pulire la superficie del tubo con etanolo al 70%.

Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 100 microlitri della sospensione di cellule reporter in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi, erogare 100 microlitri di campioni in triplicato negli appositi pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 22-24 ore.

Poco prima della fine dell'incubazione della piastra, rimuovere il substrato di rilevamento e il tampone di rilevamento dal frigorifero e posizionarli in un'area con scarsa illuminazione fino a quando non si saranno stabilizzati a temperatura ambiente. Quindi, capovolgere delicatamente ogni provetta per mescolare le soluzioni.

Immediatamente prima del completamento dell'incubazione su piastra, versare l'intero contenuto del tampone di rilevazione nella provetta del substrato di rivelazione, per creare il reagente di rilevazione della luciferasi. Mescolare delicatamente il tubo, in modo da non produrre schiuma.

Gettare il contenuto della piastra del campione in un contenitore per rifiuti appropriato e picchiettarlo delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente pulito per rimuovere le ultime goccioline dai pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di reagente di rilevamento della luciferasi a ciascun pozzetto e lasciare riposare la piastra del test a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, quantifica la luminescenza utilizzando un luminometro a 96 pozzetti con lettura della piastra.