JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:00 min. • July 8th, 2025
La crescita dei neuriti, in cui i neuroni sviluppano proiezioni, è fondamentale per la funzione neurale e la rigenerazione.
Per valutare gli effetti neurotossici dei composti di prova che promuovono la crescita dei neuriti in vitro, ottenere una sospensione di cellule progenitrici neurali umane, hNPC, in mezzi di differenziazione.
Seminare le cellule in pozzetti a piastre multipozzetto rivestiti con poli-L-lisina e laminina, facilitando l'adesione delle cellule al fondo del pozzetto e supportando la crescita cellulare. I costituenti dei mezzi di differenziazione promuovono la differenziazione delle hNPC nei neuroni.
Trattare una serie di pozzetti con un composto di prova che promuove la crescita dei neuriti. Questo interagisce con i neuroni derivati da hNPC e può indurre la crescita dei neuriti, senza interrompere i processi metabolici cellulari e la successiva concentrazione di adenosina trifosfato, ATP, la principale fonte di energia cellulare.
Aggiungere il reagente in un unico passaggio contenente detergenti, enzima luciferasi e substrato luciferasi, luciferina e inibitori dell'ATPasi insieme agli ioni magnesio e mescolare.
I detergenti distruggono la membrana cellulare, provocando la lisi cellulare e il rilascio intracellulare di ATP nella soluzione. Gli inibitori dell'ATPasi inibiscono l'ATPasi endogena rilasciata, che può interferire con la misurazione dell'ATP. Centrifuga, sedimentazione di detriti cellulari.
Durante l'incubazione, l'ATP rilasciato con gli ioni magnesio fa sì che la luciferina si leghi alla luciferasi, provocando l'ossidazione della luciferina in ossiluciferina altamente eccitata, emettendo un fotone bioluminescente al momento del rilassamento al suo stato fondamentale. Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la luminescenza, indicativa della concentrazione di ATP.
Una concentrazione più elevata di ATP rappresenta una maggiore vitalità cellulare, suggerendo che non c'è una significativa tossicità del composto in esame sui neuroni.
Per rivestire la piastra, aggiungere 30 microlitri di poli-L-lisina in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora. Lavatelo due volte con PBS e lasciatelo asciugare per circa 30 minuti.
Aggiungere 30 microlitri di laminina in ogni pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 2 ore. Ripetere i lavaggi con PBS, e procedere con la placcatura delle celle. Aggiungere 20.000 neurosfere unicellulari in 25 microlitri di mezzi di differenziazione, a ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 5 giorni.
Per la placcatura del numero esatto di neurosfere disaggregate in singole cellule sono necessarie competenze di pipettaggio ad alta precisione. Pertanto, si consiglia di differenziare le neurosfere in neuroni, prima della placcatura, per ottenere risultati più riproducibili.
Dopo l'incubazione, aggiungere 5 microlitri di composto di prova a ciascun pozzetto a 6 volte la concentrazione desiderata e incubare le cellule per altre 24 ore.
Per eseguire il test di vitalità cellulare, aggiungere 30 microlitri di reagente luminescente a ciascun pozzetto e lasciare la piastra su uno shaker per 2 minuti. Centrifugare la piastra da 300 a 400 volte g per 30 secondi. Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti, proteggendola dalla luce. Dopo l'incubazione, misurare la luminescenza su un lettore di micropiastre.