Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline per il rilevamento della mutazione Indel nei geni bersaglio
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:34 min. • July 8th, 2025
La PCR digitale con goccioline rileva le mutazioni indel, ovvero l'inserimento o la delezione casuale di nucleotidi nel DNA. Ciò si ottiene suddividendo il campione in minuscole goccioline e amplificando in modo indipendente il DNA in ciascuna gocciolina.
Per eseguire la ddPCR, prelevare un campione di DNA contenente variazioni wild-type e mutanti del gene bersaglio. Caricare la miscela di campioni e l'olio in compartimenti distinti della camera del generatore di gocce contenente il canale microfluidico.
Il campione e l'olio scorrono rapidamente attraverso gli stretti canali, si emulsionano alla giunzione e vengono suddivisi in diverse goccioline, ciascuna contenente alcune molecole di DNA.
Ora, prendi una piastra PCR con il tampone contenente primer diretti e inversi, dNTP, DNA polimerasi termostabile e due sonde etichettate con diversi fluorofori e molecole di quencher. Ogni sonda è specifica per un particolare tipo di allele, wild-type o mutante.
Trasferire le goccioline sulla piastra PCR. Posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire la reazione. Durante la denaturazione, i filamenti di DNA si separano. Alla temperatura di ricottura, i primer e le sonde si ricuociono
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