Saggio di Western Blot chemiluminescente per la lavorazione delle proteine

Il CD95 – un recettore di morte – si lega ai suoi anticorpi agonisti, innescando l'assemblaggio di un complesso di segnalazione che induce la morte, o DISC – un complesso multiproteico che recluta la procaspasi 8. Al DISC, la procaspasi 8 dimerizza e si elabora per formare vari prodotti intermedi di scissione e, infine, una forma attiva che avvia l'apoptosi.

Per analizzare il processamento della caspasi-otto mediante western blotting chemiluminescente, prendere in una provetta un lisato contenente prodotti intermedi di scissione della caspasi 8 associati a DISC. Integralo con anticorpi anti-CD95 catturati da perle di proteina A-agarosio. Gli anticorpi anti-CD95 si legano al componente DISC, il CD95, formando complessi proteici.

Caricare il campione su un gel di poliacrilammide SDS per separare gli intermedi della caspasi immunoprecipitata 8 di diverse dimensioni in bande distinte. Posizionare il gel su una membrana assorbente e applicare una corrente elettrica. Gli intermedi della caspasi 8 escono dal gel sulla membrana assorbente.

Trattare la membrana con una soluzione contenente proteine bloccanti per saturare i siti di legame delle proteine, prevenendo legami non specifici.

Aggiungere una soluzione di anticorpi primari, che si legano ai prodotti della caspasi-otto in un sito specifico.

Aggiungere anticorpi secondari marcati con enzimi che si legano specificamente alla regione Fc complementare dell'anticorpo primario per formare un complesso di scissione caspasi-otto prodotto-anticorpo primario-anticorpo secondario.

Aggiungere un substrato chemiluminescente che reagisce con l'enzima secondario coniugato con anticorpi ed emette luce. L'intensità della luce emessa è correlata alla quantità di prodotto di scissione della caspasi-otto.

Per eseguire il western blot, aggiungere 20 microlitri di tampone di caricamento 4X alle perle e riscaldare a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Contemporaneamente, riscaldare i controlli del lisato a 95 gradi Celsius per 5 minuti. Caricare i lisati, gli immunoprecipitanti e uno standard proteico su un gel SDS al 12,5% e far funzionare con una tensione costante di 80 volt.

Al termine della corsa del gel, trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa. Al termine del trasferimento, posizionare la membrana tamponata in una scatola e incubarla per un'ora in soluzione bloccante, agitandola delicatamente. Quindi, lavare la membrana tre volte per 5 minuti con PBST.

Per rilevare le proteine, aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata alla membrana e incubarlo per una notte a 4 gradi Celsius con una leggera agitazione. Il giorno successivo, lavare la membrana con tre lavaggi PBST di 5 minuti, quindi incubare la membrana con 20 millilitri di anticorpo secondario agitando delicatamente per 1 ora a temperatura ambiente.

Lavare nuovamente la membrana tre volte con PBST. Dopo aver eliminato l'ultimo lavaggio PBST, aggiungere circa 1 millilitro di substrato di perossido di rafano alla membrana e rilevare il segnale chemioluminescente.