Digestione di proteine su membrana per preparare proteine co-immunoprecipitate per studi di interazione

Per eseguire la digestione sulla membrana, prendere una soluzione di complessi proteici co-immunoprecipitati, ciascuno contenente una proteina bersaglio ricombinante marcata con GFP associata alla sua proteina partner.

Trasferire le proteine in una provetta contenente un difluoruro di polivinilidene pre-umido, una membrana in PVDF e incubarle. La superficie idrofila della membrana in PVDF aiuta a trasferire le proteine sulla membrana.

Trasferire la membrana contenente proteine in una provetta nuova. Aggiungere un tampone contenente un agente riducente per ridurre i legami disolfuro tra i residui di cisteina, portando alla denaturazione delle singole proteine nei complessi senza disturbare la loro interazione.

Sostituire questa soluzione con un reagente alchilante, che alchilizza il gruppo sulfidrilico di entrambe le proteine nei complessi e previene la riformazione dei legami disolfuro. Lavare la membrana per rimuovere il reagente in eccesso.

Trattare la membrana con un tampone contenente tripsina, un enzima proteolitico. La tripsina scinde la proteina bersaglio marcata con GFP e la sua proteina partner al terminale carbossilico dei residui di arginina e lisina, rilasciando i peptidi più piccoli nel surnatante. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo.

Lavare la membrana con una soluzione acida, dissociando eventuali peptidi legati dalla membrana, garantendo un'estrazione completa. Estrarre le frazioni contenenti peptidi in un'unica provetta. Essiccare mediante essiccazione sottovuoto.

Risospendere i residui in una bassa concentrazione di acido formico, sciogliendo i peptidi, che sono pronti per l'identificazione dell'interazione proteina-proteina.

Per preparare la membrana, tagliare le membrane in PVDF in pezzi di 3 millimetri per 3 millimetri utilizzando forbici chirurgiche che sono state pulite immediatamente prima dell'uso. Posizionare i pezzi di membrana su un foglio di alluminio e aggiungere da 2 a 5 microlitri di etanolo a ciascun pezzo. Prima che le membrane siano completamente asciutte, aggiungere da 2 a 5 microlitri di eluente proteico a ciascun pezzo e asciugarle all'aria fino a quando la superficie della membrana non diventa opaca.

Quindi, trasferire le membrane in provette da 1,5 millilitri e conservarle a 4 gradi Celsius. Se si utilizza immediatamente, aggiungere da 2 a 30 microlitri di etanolo, che li renderà idrofili. Rimuovere l'etanolo con una pipetta. Ma prima che le membrane si asciughino, aggiungere completamente 200 microlitri di soluzione di reazione a base di DTT in ciascuna provetta e incubarle a 56 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, sostituire la soluzione di reazione con 300 microlitri di soluzione di iodoacetammide e incubare al buio per 45 minuti. Quindi, lavare le membrane due volte con acqua distillata e una volta con acetonitrile al 2% agitando per almeno 10 secondi.

Lavorare con ditiotreitolo e acetonitrile può essere estremamente pericoloso. Una maschera, occhiali e guanti devono essere sempre indossati quando si esegue la procedura di digestione sulla membrana.

Preparare la tripsina secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere 100 microlitri di soluzione di reazione della tripsina a ciascuna membrana. Incubare per una notte a 37 gradi Celsius per la digestione.

Il giorno successivo, trasferire la soluzione di reazione in un tubo pulito da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di soluzioni lavate alla membrana. Incubare la membrana a 60 gradi Celsius per due ore.

Quindi, raccogliere la soluzione lavata e mescolarla con la soluzione di reazione. Aggiungere altri 100 microlitri di soluzione lavata alla membrana e sonicarla per 10 minuti. Quindi, raccogliere la soluzione lavata e mescolarla con la soluzione di reazione. Coprire la provetta con un pezzo di pellicola da laboratorio e praticare piccoli fori nella pellicola con un ago.

Asciugare la soluzione utilizzando un concentratore sottovuoto e sciogliere il residuo in 10 microlitri di acido formico allo 0,2%. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per tre minuti e trasferire il surnatante in una provetta per campioni.

Analizzare il campione utilizzando uno spettrometro di massa collegato a un sistema HPLC nano-LC.