Digestione di proteine su membrana per preparare proteine co-immunoprecipitate per studi di interazione

Per eseguire la digestione sulla membrana, prendere una soluzione di complessi proteici co-immunoprecipitati, ciascuno contenente una proteina bersaglio ricombinante marcata con GFP associata alla sua proteina partner.

Trasferire le proteine in una provetta contenente un difluoruro di polivinilidene pre-umido, una membrana in PVDF e incubarle. La superficie idrofila della membrana in PVDF aiuta a trasferire le proteine sulla membrana.

Trasferire la membrana contenente proteine in una provetta nuova. Aggiungere un tampone contenente un agente riducente per ridurre i legami disolfuro tra i residui di cisteina, portando alla denaturazione delle singole proteine nei complessi senza disturbare la loro interazione.

Sostituire questa soluzione con un reagente alchilante, che alchilizza il gruppo sulfidrilico di entrambe le proteine nei complessi e previene la riformazione dei legami disolfuro. Lavare la membrana per rimuovere il reagente in eccesso.

Trattare la membrana con un tampone contenente tripsina, un enzima proteolitico. La tripsina scinde la proteina bersaglio marcata con GFP e la sua proteina partner al terminale carbossilico dei residui di arginina e lisina, rilasciando i pepti