Saggio di immunoprecipitazione per studiare le interazioni dei recettori enzimatici nelle cellule trasfettate

La morte programmata-1, PD-1, una proteina del recettore della superficie cellulare, contiene due motivi citoplasmatici della tirosina: il motivo inibitorio, ITIM, e il motivo dell'interruttore, ITSM. Il legame con il ligando induce la fosforilazione di ITIM e ITSM e il reclutamento della proteina tirosin-fosfatasi SHP2 nel dominio citoplasmatico di PD-1, innescando una cascata di segnalazione a valle.

Per studiare le interazioni SHP2-PD-1 tramite un saggio di co-immunoprecipitazione, ottenere una coltura di cellule epiteliali aderenti. Queste cellule esprimono proteina fluorescente verde, PD-1 wild-type marcata con GFP con ITIM e ITSM fosforilati. Ottenere cellule epiteliali che esprimono PD-1 mutante marcato con GFP, in cui le mutazioni ITIM o ITSM inibiscono la loro fosforilazione.

Aggiungere il tampone di lisi contenente detergente e ortovanadato di sodio. I detergenti lisano le cellule, causando il rilascio della proteina PD-1 marcata con GFP. I blocchi dell'ortovanadato di sodio hanno rilasciato fosfatasi, prevenendo così la defosforilazione di ITIM e ITSM.

Centrifugare il lisato. Trasferire il surnatante contenente proteine in tubi freschi. Aggiungere perle di agarosio rives