Saggio di immunoprecipitazione per studiare le interazioni dei recettori enzimatici nelle cellule trasfettate

La morte programmata-1, PD-1, una proteina del recettore della superficie cellulare, contiene due motivi citoplasmatici della tirosina: il motivo inibitorio, ITIM, e il motivo dell'interruttore, ITSM. Il legame con il ligando induce la fosforilazione di ITIM e ITSM e il reclutamento della proteina tirosin-fosfatasi SHP2 nel dominio citoplasmatico di PD-1, innescando una cascata di segnalazione a valle.

Per studiare le interazioni SHP2-PD-1 tramite un saggio di co-immunoprecipitazione, ottenere una coltura di cellule epiteliali aderenti. Queste cellule esprimono proteina fluorescente verde, PD-1 wild-type marcata con GFP con ITIM e ITSM fosforilati. Ottenere cellule epiteliali che esprimono PD-1 mutante marcato con GFP, in cui le mutazioni ITIM o ITSM inibiscono la loro fosforilazione.

Aggiungere il tampone di lisi contenente detergente e ortovanadato di sodio. I detergenti lisano le cellule, causando il rilascio della proteina PD-1 marcata con GFP. I blocchi dell'ortovanadato di sodio hanno rilasciato fosfatasi, prevenendo così la defosforilazione di ITIM e ITSM.

Centrifugare il lisato. Trasferire il surnatante contenente proteine in tubi freschi. Aggiungere perle di agarosio rivestite di anticorpi anti-GFP. Le proteine PD-1 marcate con GFP si legano agli anticorpi anti-GFP.

Incubare con la sospensione SHP2. Il PD-1-GFP legato a perle lega SHP2 tramite ITIM e ITSM fosforilati.

Aggiungere il tampone Laemmli e far bollire in modo che gli agenti riducenti e i detergenti nel tampone denaturano i complessi proteici PD-1-GFP-SHP2. Centrifugare e raccogliere il surnatante contenente i complessi proteici denaturati. Eseguire SDS-PAGE e western blot.

PD-1 wild-type e ITIM-mutato interagisce con SHP2. I mutanti ITSM non riescono a legare SHP2, indicando che l'interazione PD1-SHP2 richiede ITSM fosforilato.

Durante l'esecuzione dell'immunoprecipitazione, tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio o a 4 gradi Celsius. Integrare il tampone di lisi con inibitori della proteasi sciogliendo una compressa di inibitori in 10 millilitri di tampone. Inoltre, aggiungere 1 millimolare di ortovanadato di sodio al tampone che verrà utilizzato sulle piastre trasfettate PD1-GFP. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciato alle cellule, assicurandosi di aggiungere il tampone di lisi contenente l'ortovanadato di sodio solo alle piastre contenenti cellule trasfettate PD1-GFP.

Utilizzare un raschietto per cellule per rimuovere e raccogliere immediatamente le cellule dalle piastre. Trasferire i lisati in tubi freddi da 1,5 millilitri e ruotarli a 0,005 volte g e a 4 gradi Celsius per 30 minuti. Per raccogliere il surnatante post-nuclei dai lisati, centrifugarli a 10.000 volte g e 4 gradi Celsius per 10 minuti.

Trasferire i surnatanti in nuovi tubi e scartare il pellet. Conservare i surnatanti per la seconda serie di sei piastre su ghiaccio, per la successiva analisi WCL.

Per iniziare a preparare le perle anti-GFP, agitare delicatamente il flacone contenente le perle prima di aprirlo per evitare che si depositino. Rimuovere 40 microlitri di perle anti-GFP dal liquame per ogni condizione. Centrifugare a 500 volte g e 4 gradi Celsius per 3 minuti. Rimuovere il surnatante per lavare le perle, assicurandosi di ridurre al minimo il contatto tra la pipetta e le perle per evitare perdite.

Risospendere le perle in 80 microlitri di tampone di lisi per campione. Aggiungere le perle lavate direttamente al lisato cellulare dalle cellule che esprimono PD1-GFP della prima serie di quattro piastre. Ruotare a 0,005 volte g per 30 minuti a 4 gradi Celsius per immunoprecipitare le proteine marcate con GFP. Lavare le perle tre volte utilizzando 1 millilitro di tampone di lisi a freddo che non contenga ortovanadato per ogni lavaggio. Quindi, centrifugare a 2.500 volte g per 10 secondi.

Dividere il lisato dell'attivo SHP2 dalla prima serie di piastre in tre parti uguali e aggiungere una porzione a ciascuna delle tre provette contenenti le perle PD1-GFP lavate. Aggiungere 1/3 del volume del lisato dalle cellule non trasfettate alla seconda provetta delle perle PD1-GFP wild-type. Scartare i restanti 2/3.

Incubare le perle per 4 ore a 4 gradi Celsius con una rotazione delicata a 0,005 volte g. Successivamente, lavare le perle due volte, utilizzando 1 millilitro di tampone di lisi fredda per ogni lavaggio. Aggiungere 80 microlitri di tampone di lisi a ciascun campione, assicurandosi che il volume totale in ciascuna provetta sia di 100 microlitri. Utilizzando un puntale di pipetta tagliato, pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Quindi, trasferire 50 microlitri da ciascuna provetta in due provette fresche da 1,5 millilitri.

Per prima cosa, centrifugare le perline a 2.000 volte g e 4 gradi Celsius per 30 secondi e rimuovere il surnatante. Aggiungere 20 microlitri di tampone Laemmli 2x e far bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando un kit BCA, misurare la concentrazione proteica dei controlli di input.

Trasferire 30 microlitri del campione più diluito in una nuova provetta. Utilizzare il tampone di lisi per diluire il resto dei controlli di input alla stessa concentrazione del campione più diluito. Quindi, trasferire 30 microlitri di ciascuno dei controlli di input diluiti in una nuova provetta. Aggiungere volumi uguali di 2x tampone Laemmli ai lisati e farli bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Successivamente, centrifugare le perle a 2.000 volte g e 4 gradi Celsius per 30 secondi prima di eseguire l'analisi Western blot come indicato nel protocollo di testo.